張嬙，熊祥（.北方民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川75002；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，安徽合肥230009）

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響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉多糖的超聲波輔助萃取工藝

張嬙1，2，熊祥1
（1.北方民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川750021；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院，安徽合肥230009）

摘要：利用桑樹葉片為原料，運(yùn)用響應(yīng)面法對桑葉多糖的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。根據(jù)BOX（Box-Benhnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定超聲時間、超聲溫度、萃取液固比對桑葉多糖提取率的影響。結(jié)果表明：超聲波輔助萃取桑葉多糖的最佳工藝條件為超聲溫度52℃，超聲時間36min，液固比40∶1（mL/g），在此萃取條件下，多糖的萃取率可達(dá)3.21%。

關(guān)鍵詞：桑葉；多糖；超聲輔助提??；響應(yīng)面分析

桑葉（Mulberry Leaves），又名“鐵扇子”，在全世界該屬植物大約有16種，中國是世界上桑葉的主要產(chǎn)地之一，主要分布于四川和江浙等蠶養(yǎng)殖量較大的地方。《本草綱目》記載：“桑葉可汁煎代茗，常服可令人膚色光澤，養(yǎng)顏健胃，安魂鎮(zhèn)神，稱之為神仙葉。[1]”

桑葉的化學(xué)成分較復(fù)雜，不僅含蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸、纖維素、碳水化合物等營養(yǎng)成分，而且含有大量的生物活性物質(zhì)如桑苷、γ-氨基丁酸、生物堿、黃酮及多糖類物質(zhì)等[2]。研究表明桑葉的不同部位具有明顯的生物活性，尤其是桑葉多糖具有顯著的降血糖和降血脂作用，被廣泛用于藥品和功能性食品中[3]。

目前我國對桑葉的利用主要是飼養(yǎng)桑蠶。殘?jiān)淮罅慷逊e，不僅造成了極大的資源浪費(fèi)，還造成環(huán)境的污染。鑒于此，本課題以桑葉為原料，運(yùn)用超聲波輔助萃取技術(shù)著重研究桑葉多糖的最佳萃取參數(shù)，以期為以后桑葉多糖的大規(guī)模生產(chǎn)和其產(chǎn)品的深加工提供可行性參考。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

桑葉：采自北方民族大學(xué)校內(nèi)；葡萄糖、濃硫酸、苯酚均為分析純。

紫外可見分光光度計(jì)、YP2001N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；低溫超聲波萃取儀：上海比朗儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理

將原料自然干燥后，機(jī)械粉碎，然后過篩使其桑葉粉末達(dá)到40目。

1.2.2單因素試驗(yàn)

稱取一定量的桑葉粉末，裝入燒瓶中進(jìn)行超聲波輔助萃取。分別對超聲溫度、超聲時間、液固比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探討其對超聲輔助萃取效果的影響。

1.2.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken Design（BBD）中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取超聲溫度、超聲時間、液固比為自變量，以桑葉多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析[4]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼表Table 1 Factors and levers of response surface experiments

1.2.4桑葉多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量[5]，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.046 8X-0.026 9（R2=0.999 0）。

桑葉多糖萃取率/%=萃取液中多糖濃度（mg/mL）×萃取液體積（mL）/萃取原料質(zhì)量（mg）×100

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1超聲時間的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的桑葉，保持超聲溫度、萃取液固比不變，改變不同的超聲時間，其對桑葉多糖萃取率的影響如圖1所示。

圖1超聲時間對桑葉多糖萃取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，桑葉多糖的提取率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，超過30 min后，多糖得率逐漸降低，30 min時出現(xiàn)最佳值。其原因可能是隨萃取時間的延長桑葉多糖不斷的溶出，超聲時間越長，多糖得率越高。但擴(kuò)散達(dá)到平衡后，超聲時間過長，由于超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長時間的超聲作用會使大分子的多糖斷裂，從而多糖降低[6]。

2.1.2超聲溫度對桑葉多糖萃取效果的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的桑葉，保持超聲時間、萃取液固比不變，改變不同的超聲溫度，其對桑葉多糖萃取率的影響如圖2。

圖2超聲溫度對桑葉多糖萃取率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield

如圖2所示，隨著超聲溫度的升高，桑葉多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，超聲溫度為50℃時，得率最高。其原因可能是溫度的升高，有利于增加溶劑的滲透能力，加快桑葉多糖從細(xì)胞向外擴(kuò)散的速率，使得多糖得率升高。溫度過高，會破壞多糖的結(jié)構(gòu)影響其活性[7]。

2.1.3液固比的影響

準(zhǔn)確稱取一定量的桑葉，保持超聲溫度、超聲時間不變，改變不同的萃取液固比，其對桑葉多糖萃取率的影響如圖3。

圖3液固比對桑葉多糖得率的影響Fig.3 The effect of solid-liquid ratio

如圖3可知，隨著液固比的增加，桑葉多糖得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，液固比為40∶1（mL/g）時多糖得率趨于平緩。這是因?yàn)閷τ谝欢ǖ脑?，隨著溶劑的增加，原料與溶劑的接觸界面的濃度差增大，從而提高了多糖的擴(kuò)散速度，多糖得率增大。溶劑量過大，雜質(zhì)等析出，不利于后續(xù)分離，故選擇液固比40∶1（mL/g）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

運(yùn)用Box-Behnken design法，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2，對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and corresponding experimental values

表3響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for yield of MLP with extraction conditions

使用Design-Expert 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，以超聲溫度、超聲時間、液固比為響應(yīng)變量，以桑葉多糖萃取率為響應(yīng)值，得到表3結(jié)果，預(yù)測模型如下：

Y＝3.08+0.15A+0.051B+0.066C+0.22AB-0.013AC-0.19BC-0.18A2-0.11B2-0.47C2

比較F值的大小可知各因素對多糖得率的影響順序是超聲溫度>液固比>超聲時間。該模型整體“Prob>F”值小于0.05，說明具有顯著性，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，可以用于桑葉多糖的超聲萃取實(shí)驗(yàn)的預(yù)測。且該模型失擬項(xiàng)的Pr >F值大于0.05，不顯著，所以該方程對試驗(yàn)擬合是可靠的。

2.3各因素之間的交互作用分析

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)圖形是特定的響應(yīng)面Y對應(yīng)的因素A、B、C構(gòu)成的一個三維空間在二維平面的等高圖，可以直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面的坡度的陡峭程度說明隨著影響因素的變化，其對應(yīng)響應(yīng)值的變化情況[8]。各因素之間的交互作用對桑葉多糖得率影響的響應(yīng)面圖如圖4～圖6。

從圖4～圖6中可知，桑葉多糖萃取率隨超聲時間的增加先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值。液固比的改變也會不同程度的影響多糖萃取率，而超聲溫度對多糖萃取率的影響相對不明顯。超聲溫度和時間，超聲溫度和液固比及超聲時間與液固比的交互作用較顯著；通過響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測最優(yōu)萃取條件為超聲溫度52.14℃，超聲時間36.09 min，萃取液固比40.11∶1（mL/g），在此萃取條件下，桑葉多糖的得率最高可達(dá)3.12 %。

圖4超聲溫度與超聲時間的交互效應(yīng)曲面圖Fig.4 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic temperature and time

圖5超聲溫度與液固比交互效應(yīng)曲面圖Fig.5 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio

圖6超聲時間與液固比交效應(yīng)曲面圖Fig.6 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic time and liquid-solid ratio

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證回歸模型的有效性，利用響應(yīng)面得到的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由回歸方程確定超聲萃取桑葉多糖的最佳條件為超聲溫度52℃，超聲時間為36 min，液固比40∶1（mL/g），為了驗(yàn)證該參數(shù)，設(shè)計(jì)了3組平行試驗(yàn)，得到的桑葉多糖萃取率平均值為3.21%，與預(yù)測值3.12 %相近。由此證明回歸方程擬合良好，試驗(yàn)結(jié)果理想。

3　結(jié)論

本研究將響應(yīng)面優(yōu)化和超聲波萃取結(jié)合，通過Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)，模擬得到提取桑葉多糖的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型是合理可靠的，能較好的預(yù)測桑葉多糖得率。通過對其關(guān)鍵因素及相互作用進(jìn)行探討，確定超聲萃取桑葉多糖的因素影響程度：超聲溫度>萃取液固比>超聲時間。經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化分析得，并采用回歸方程修正得到最佳工藝參數(shù)為粉碎粒度為超聲溫度52℃，超聲時間36 min，萃取液固比40∶1（mL/g），在此萃取條件下，桑葉多糖的得率為3.21 %。與傳統(tǒng)提取方法相比，萃取時間短，操作工藝簡單，為進(jìn)一步開發(fā)高附加值的桑葉多糖提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharide from Mulberry Leaves by Response Surface Methodology

ZHANG Qiang1，2，XIONG Xiang1
（1. College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2. College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

Abstract：Technological conditions of extraction of mulberry leaves with ultrasound-assisted extraction were optimized for developing and utilizing the resource of mulberry leaves，by response surface methodology as the method of studying polysaccharide of mulberry leaves. According to the principle of Box -Behnken central composite design，ultrasonic time，extraction temperature and solid -liquid ratio were chosen as response factors，extraction of Polysaccharide from mulberry leaves（MLP）mass as response value，and a three-factor and three levels central composite design was adopted to determine the influence of various technological conditions. The results showed that better extraction conditions were 52℃of temperature，36 min of period，40∶1（mL/g）of liquid - solid ratio. Under these conditions，the yield of MLP was 3.21 %.

Key words：mulberry leaves；polysaccharide；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

收稿日期：2015-05-27

作者簡介：張嬙（1980—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功效研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.030