夏玲芝，曹鵬，李曉娥，許濤，Khawar Ali Shahzad，毛源，張厚智，沈傳來（.南京金域醫(yī)學檢驗所實驗診斷部，江蘇南京000；.東南大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學系江蘇南京0009）

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人類白細胞抗原-B等位基因多態(tài)性與江蘇地區(qū)漢族人群2型糖尿病的相關(guān)性研究*

夏玲芝1，曹鵬1，李曉娥2，許濤2，Khawar Ali Shahzad2，毛源1，張厚智1，沈傳來2
（1.南京金域醫(yī)學檢驗所實驗診斷部，江蘇南京210002；2.東南大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學系江蘇南京210009）

摘要：目的探討人類白細胞抗原（HLA-B）等位基因多態(tài)性與江蘇地區(qū)漢族人群2型糖尿病的相關(guān)性。方法采用聚合酶鏈反應直接測序分型法（PCR-SBT）對118例江蘇地區(qū)漢族2型糖尿?。═2DM）個體進行HLA-B等位基因分型，計算各等位基因頻率和血清型頻率，并與中華骨髓庫江蘇分庫漢族志愿者人群（644例和20 248例）進行統(tǒng)計學比較。結(jié)果HLA-B*1501的等位基因頻率在江蘇地區(qū)漢族T2DM人群中明顯升高（8.90% vs 3.03%，Pc= 0.000，而HLA-B*5801的等位基因頻率則明顯下降（1.69% vs 8.62%，Pc=0.000，相對應地，HLA-B*15的血清型頻率在江蘇地區(qū)漢族T2DM人群中明顯升高（21.18% vs 13.03%，Pc=0.022，2.55，Power=90.15%），而HLA-B*58的血清型頻率則明顯下降（1.69% vs 8.62%，Pc=0.000，0.07～0.50，Power=91.09%）。結(jié)論HLA-B*1501等位基因可能與江蘇地區(qū)漢族人群2型糖尿病的易感性有關(guān)，而HLA-B*5801則可能有保護作用。這些結(jié)果首次提示HLA-I類基因多態(tài)性可能與中國人群2型糖尿病有關(guān)。

關(guān)鍵詞：2型糖尿??；HLA-B；等位基因多態(tài)性；PCR-SBT

人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）基因定位于第6號染色體短臂6p21.31區(qū)，是迄今所知人類多態(tài)性最豐富的遺傳系統(tǒng)，在不同種族或同一種族不同群體中的等位基因分布有明顯的種群特性，也是最能代表個體特異性的遺傳物質(zhì)。其功能主要表現(xiàn)在對機體免疫應答反應的啟動和調(diào)節(jié)控制，與很多疾病的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性。對各類疾患人群進行HLA基因型別和頻率的分析對疾病機制的研究具有重要啟示作用。

我國是糖尿病大國，成人中發(fā)病率約9%，其中2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）占90%以上。目前認為2型糖尿病是由環(huán)境和遺傳因素共同作用的代謝紊亂性疾病，不同遺傳背景的個體在相同環(huán)境中的患病危險性不同。環(huán)境因素如高熱量飲食、缺乏體力活動等作用于糖尿病易感者使患病率日益升高[1]。多年來，人們利用候選基因關(guān)聯(lián)研究策略和近來的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已鑒定出幾十個與T2DM相關(guān)的基因位點。在中國人群中這些位點與T2DM的風險關(guān)系還在進一步驗證[2-3]。20多年來關(guān)于HLA基因多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性研究在國內(nèi)外也不斷有報道。但絕大多數(shù)研究都聚焦于HLADR和DQA1、DQB1等HLA-II類基因與各民族T2DM的關(guān)聯(lián)性研究。比如：美國黑人T2DM與HLA-DR3、DR4有關(guān)聯(lián)[4]；HLA-DRB1*070101在黎巴嫩人和巴林島人的T2DM中以及HLA-DQB1*0201在黎巴嫩人的T2DM人群中是易感基因[5]；維生素D受體的基因多態(tài)性與HLA-DRB1*04共同作用顯著增加了沙特阿拉伯人群T2DM的危險性[6]。在中國T2DM人群中HLA-DQA1和DQB1的研究較多，比如云南漢族[7]和彝族[8]，廣西漢族[9]和壯族[10]以及新疆維吾爾族[11]與HLA-DQA1的關(guān)聯(lián)；2013年，Ma等[12]報道HLA-DQA1*0301和0501等位基因是中國漢族T2DM的易感基因，而HLA-DQB1*0501是T2DM合并腎病的保護性基因。關(guān)于HLA-I類基因，如HLA-A、HLA-B等與T2DM的相關(guān)性研究則很少，比如美國亞拉巴馬州的非裔婦女的HLA-B41和HLA-DR2升高是T2DM的獨立危險因素[13]。中國T2DM中HLA-I類基因的研究尚未見報道。

本課題組在從人血標本中克隆所有頻率>1% 的HLA-B等位基因時，有意識地隨機選取標本量較多的江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病患者群的118例血液標本，運用聚合酶鏈反應直接測序分型法（Polymerase chain reaction-sequence based typing，PCRSBT）技術(shù)進行HLA-B等位基因分型，在基因水平上初步探討了江蘇地區(qū)漢族T2DM人群HLA-B的等位基因多態(tài)性分布狀況，并發(fā)現(xiàn)HLA-B*1501（B*15）和HLA-B*5801（B*58）的等位基因頻率和血清型頻率與江蘇地區(qū)漢族健康人群存在顯著差異性。盡管研究例數(shù)偏少，但這一結(jié)果能提示我國糖尿病研究者應重視HLA-I類基因多態(tài)性與2型糖尿病間的關(guān)聯(lián)。

1　資料與方法

1.1調(diào)查對象

在南京金域醫(yī)學檢驗所實驗室隨機選取江蘇地區(qū)漢族無親緣關(guān)系的T2DM成人患者血液標本共計118例。其中，男性57例，女性61例，年齡24～94歲，平均（56.3±16.1）歲。所有患者來自江蘇省各縣、區(qū)醫(yī)院門診和住院患者，均經(jīng)當?shù)鼐驮\醫(yī)院明確診斷為T2DM，符合1999年世界衛(wèi)生組織推薦的T2DM診斷標準。所有樣本采樣時的糖化血紅蛋白（HbA1c）≥7.0%。

1.2主要實驗儀器及試劑

DNA提取試劑盒（北京天根公司），PCR儀（美國BioRad公司），電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠成像儀（上海培清公司），高保真DNA聚合酶（諾維贊公司）。

1.3基因組DNA制備

按照DNA提取試劑盒的操作步驟來提取基因組DNA。用紫外分光光度計測定DNA純度和濃度，A260/280值介于1.6～1.8，調(diào)濃度至80 ng/μl左右，-20℃冰箱保存。

1.4特異性PCR擴增

以基因組DNA為模板，用WHO國際組織相容性工作組（International Histocompatibility WorkingGroup，IHWG）推薦的特異性PCR引物（見表1，PF1 和PR1）擴增HLA-B的第2，3外顯子，得到長度大約為919 bp的DNA片段。PCR反應條件為：95℃預變性10 min；然后95℃變性15 s，70℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。

1.5PCR產(chǎn)物割膠純化并測序

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，之后對919 bp左右的目的片段進行割膠純化。將純化后的PCR產(chǎn)物送上海桑尼測序公司，用針對第2，3外顯子的特異性測序（見表1，PF2和PR2，PF3和PR3）引物進行雙向測序。

1.6PCR-SBT分型

用Seqman軟件將每個樣本的4個測序結(jié)果拼接成一個完整的重疊序列后，用NCBI的dbMHC數(shù)據(jù)庫在線分析工具SBT Input對其進行HLA-B等位基因分型。

1.7統(tǒng)計學方法

通過直接計數(shù)法統(tǒng)計出各等位基因的頻率，基因頻率（GF）=陽性基因數(shù)/個體總數(shù)×2。利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，對不同人群間等位基因頻率進行2×2列聯(lián)表批量χ2檢驗計算P值，當理論頻數(shù)>1且<5時，采用連續(xù)性校正χ2檢驗，當理論頻數(shù)<1時，使用Fisher精確概率檢驗。利用SNP tools for Microsoft Excel軟件計算OR （95%CI）和Power值。P值進行Bonferroni多重檢驗校正，Pc=P×等位基因或血清型的個數(shù)。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1　HLA-B基因位點特異性的擴增和測序引物

2　結(jié)果

2.1江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群中HLA-B等位基因頻率的分布

通過對118例江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病個體進行PCR-SBT分型后得到32個HLA-B等位基因（見表2）。其中等位基因頻率>5%的等位基因有6種，分別是HLA-B*4601（14.41%），HLA-B*4001（11.86%），HLA-B*1302（10.17%），HLA-B*1501 （8.90%），HLA-B*1301（7.63%）和HLA-B*4403 （5.08%）。這6種等位基因的頻率合計為58.05 %，占該人群的大多數(shù)；另外，還檢測到7種頻率<1% 的HLA-B等位基因。由于所檢測的病例數(shù)和所獲得的等位基因數(shù)均偏少，因此未對其基因的多態(tài)性分布進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗。圖1是代表性的PCR電泳圖，圖2是代表性的PCR產(chǎn)物基因測序圖。

圖1　HLA-B基因位點特異性PCR產(chǎn)物

2.2與江蘇地區(qū)健康人群HLA-B等位基因頻率的比較

將118名江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群的HLA-B等位基因頻率與中華骨髓庫江蘇分庫漢族志愿者人群（644例[14]）進行統(tǒng)計學比較。后者644例志愿者的數(shù)據(jù)是采用與本研究相同的PCR-SBT分型技術(shù)獲得，所用的PCR引物也是IHWG推薦的標準引物。結(jié)果如表2所示：有2個HLA-B等位基因的頻率在江蘇地區(qū)漢族T2DM人群中明顯提升，即B*1501（8.90%vs3.03%，Pc=0.000，I=1.80~5.42，Power=98.23%）和B*4402（1.69% vs 0.08%，Pc=0.032，95%CI=2.47~199.42， Power=79.01%）。其中B*1501與T2DM人群呈正相關(guān)最為可信，因為它的3個統(tǒng)計分析指標差異都有統(tǒng)計學意義：Pc<0.01，且其95%可信區(qū)間的下限>1.5，Power值（統(tǒng)計功效）>80%，高達98.23%。統(tǒng)計顯示，有1個HLA-B等位基因的頻率在T2DM人群中明顯下降，即B*5801（1.69% vs 8.62%，Pc= 0.000，95%CI=0.07~0.50，Power=91.07%），其值95%可信區(qū)間的上限≤0.5，Power>80%，與T2DM人群呈負相關(guān)較為可信。統(tǒng)計功效（statisticalpower）是假設(shè)檢驗能夠正確偵測到真實的處理效應的能力。一般認為，一個研究在Power>80%時才能比較有把握地保證總體中存在的現(xiàn)象可以通過樣本檢驗得到識別，統(tǒng)計結(jié)果才比較可靠。本研究中的B*1501和B*5801的基因頻率與健康人群的差異性統(tǒng)計Power值均超過90%，提示盡管研究的樣本量偏少（118例），但是它們與江蘇漢族人群T2DM呈正相關(guān)或負相關(guān)的統(tǒng)計分析還是可信的。

表2　江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群與江蘇地區(qū)漢族健康人群HLA-B等位基因頻率的比較

2.3與江蘇地區(qū)健康人群HLA-B等位基因血清型頻率的比較

圖2　雜合子HLA-B*1501/*4001（sample28）基因測序峰圖（140-190 bp）

表3　江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群與江蘇地區(qū)漢族健康人群HLA-B血清型（抗原）頻率的比較

將118名江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群的HLA-B等位基因血清型頻率分別與中華骨髓庫江蘇分庫644例[14]和20 248例[15]漢族志愿者人群進行統(tǒng)計學比較。其中20 248例志愿者的數(shù)據(jù)是通過PCR-SSP和PCR-SSOP技術(shù)獲得，只能精確到HLA-B等位基因的血清型（抗原型）。與644例中華骨髓庫江蘇分庫的漢族志愿者人群比較（見表3），HLA-B*15血清型的頻率在T2DM人群中顯著增高（21.18% vs 13.03%，Pc=0.022，1.26~2.55，Power=90.15%）。另外，HLA-B*58血清型的頻率在T2DM人群中顯著減低（1.69% vs 8.62%,Pc=0.000，95%CI=0.07~0.50，Power=91.09%）。與20 248例中華骨髓庫江蘇分庫的漢族志愿者人群比較（見表4），HLA-B*59血清型的頻率在江蘇地區(qū)漢族T2DM人群中顯著提高（1.69% vs 0.2%，P= 0.000，Pc=0.000，Power=98.64%），而B*15血清型的頻率也有增高，但Pc值未能<0.05（21.18% vs 14.4%，P =0.003，Pc=0.066，OR=1.60，95%CI=1.17~2.19，Power=83.43%）。另有B*51（Pc=0.022，）和B*58（Pc=0.044，）的頻率在T2DM人群中顯著降低。

表4　江蘇地區(qū)漢族2型糖尿病人群與江蘇地區(qū)漢族健康人群HLA-B血清型（抗原）頻率的比較

由于20 248例中華骨髓庫江蘇分庫志愿者的數(shù)據(jù)是采用非基因測序方法獲得，不同于本研究的HLA-B等位基因分型方法，因此在血清型頻率的統(tǒng)計中可能有部分誤差。但是，B*15和B*59等位基因在T2DM人群中的血清型頻率分別在與上述644例和20 248例漢族志愿者人群相比中呈顯著性增高，其中B*15血清型頻率的顯著性增高較為可信；同樣B*58在T2DM人群中的血清型頻率與上述兩個健康人群比較均顯著性下降。在HLA-B等位基因頻率的比較中，B*1501和B*5801頻率在江蘇地區(qū)漢族T2DM人群中分別顯著升高和降低，與血清型頻率比較的結(jié)果相一致。這些結(jié)果提示：HLA-B*1501（B*15）可能是江蘇地區(qū)漢族人群T2DM的易感基因，而HLA-B*5801（B*58）則可能是保護基因。

3　討論

HLA基因是目前已知的人類最為復雜的遺傳系統(tǒng)。盡管其功能尚未完全清晰，但是它與很多疾病的關(guān)聯(lián)性已被充分證實。1型糖尿病（T1DM）已被證實與HLA基因區(qū)域顯著關(guān)聯(lián)，可以解釋其近40%的遺傳易感性，其余基因的作用則較小[16]。2型糖尿?。═2DM）與1型糖尿病的發(fā)病機制不同，但都與遺傳因素有關(guān)。是否HLA等位基因多態(tài)性與T2DM相關(guān)聯(lián)尚無定論，但不斷有報道。在中國，多個種族的T2DM人群被研究，但都是關(guān)于HLA-DQA1和DQB1等位基因關(guān)聯(lián)性的分析。楊紅英等[7]先后對云南108例漢族T2DM患者和58例彝族T2DM患者進行研究，發(fā)現(xiàn)DQA1*0301、0501是云南漢族T2DM的易感基因，而DQA1*0401是保護基因，DQA1*0302是T2DM合并腎病的易感基因；HLADQA1*0301是云南彝族T2DM的易感基因，DQA1*0601則是保護基因[8]。梁敏等[9]研究了72例廣西漢族T2DM患者，發(fā)現(xiàn)T2DM組的DQA1*0104等位基因頻率明顯高于正常對照組（P <0.01，RR=6.51)，DQA1*0401等位基因頻率則明顯低于正常對照組（P<0.001，RR=0.29）。隨后梁杏歡等[10]研究了67例廣西壯族T2DM患者，顯示HLA-DQA1*0301、0401基因頻率明顯高于正常對照組，可能為壯族T2DM發(fā)病的易感基因。其中DQA1*0401在上海[17]、廣西和云南的漢族T2DM研究中則顯示可能是保護基因。劉鳳霞[11]對73例新疆維吾爾族T2DM的研究顯示，HLA-DQA1*0104可能是新疆吐魯番地區(qū)維吾爾族體T2DM的易感基因。2013年，Ma等[12]研究了310例漢族T2DM患者和100例健康者，認為HLADQA1*0301（15.5% vs 8.0%，P <0.01）和0501 （16.6% vs 8.5%，P <0.01）等位基因是中國漢族T2DM的易感基因，而HLA-DQB1*0501是T2DM合并腎病的保護性基因。

本研究采用“金標準”的PCR-SBT分型技術(shù)對118例江蘇地區(qū)漢族的T2DM人群進行了HLA-B等位基因多態(tài)性研究，并與同樣采用PCR-SBT分型技術(shù)獲得的江蘇地區(qū)漢族骨髓捐獻者人群（644例）的HLA-B等位基因分布頻率[14]進行了統(tǒng)計學比較，發(fā)現(xiàn)HLA-B*1501等位基因的頻率在T2DM人群中明顯升高，而HLA-B*5801的頻率則在T2DM人群中顯著下降。血清型頻率的比較也得出一致的結(jié)果。由于研究的病例數(shù)偏少，而且對照組數(shù)據(jù)雖是健康者但非體檢人群，目前數(shù)據(jù)尚不足以證實這2 個HLA-B等位基因與T2DM的關(guān)聯(lián)性，但這一結(jié)果對我國糖尿病研究者則是一個提醒：HLA-I類基因的多態(tài)性是否與T2DM有關(guān)聯(lián)性值得注意。本研究將繼續(xù)擴大檢測標本量，以進一步明確這一結(jié)果的可信性。

HLA-I類基因在人體細胞的表達范圍和抗原提呈功能均與HLA-Ⅱ類基因有明顯不同。前者表達于除絨毛外滋養(yǎng)細胞外的所有有核細胞表面，提呈內(nèi)源性抗原，包括來自細胞內(nèi)的自身抗原、腫瘤抗原、病毒抗原等，介導CD8+T細胞的活化；后者主要表達于巨噬細胞、DC、成熟B細胞以及激活的T細胞和單核細胞表面，提呈外源性抗原，激活CD4+T細胞。HLA某些等位基因與特定疾病的關(guān)聯(lián)性與其在特定人種或人群中的頻率高低有關(guān)，更與其提呈特定抗原肽的能力強弱有關(guān)。T2DM是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中HLA-I類基因與T2DM的相關(guān)性研究很少，目前只報道美國亞拉巴馬州非裔婦女的HLA-B41和HLA-DR2升高是T2DM的獨立危險因素，未涉及機制探討[13]。本研究初步顯示B*1501和B*5801與江蘇地區(qū)漢族人群的T2DM有關(guān)，其可能提呈的與T2DM有關(guān)的優(yōu)勢抗原肽或者其他的非抗原提呈功能等仍待深入研究。

HLA的分型主要經(jīng)歷了兩個階段：HLA血清學分型和基因分型技術(shù)。血清學分型法具有便捷、經(jīng)濟、有效等優(yōu)點，但準確性不高?；蛐头中图夹g(shù)主要有PCR-SSOP（序列特異性寡核苷酸探針）、PCR-SSP（序列特異性引物）以及PCR-SBT（直接測序分型）等3種方法。PCR-SBT法是用PCR擴增獲得HLA基因座位的DNA片段，然后對DNA測序，根據(jù)堿基序列進行分型，比其他分型方法更為準確，稱為HLA分型的“金標準”。本文運用PCR-SBT技術(shù)以及國際標準的PCR擴增引物對江蘇漢族T2DM個體的HLA-B基因座位第2、3外顯子進行擴增和測序，分型結(jié)果是可信的。本研究在118例T2DM個體中檢測到32個HLA-B等位基因。與江蘇地區(qū)漢族骨髓捐獻者人群比較后，初步顯示HLA-B*1501（B*15）可能是江蘇地區(qū)漢族人群T2DM的易感基因，而HLA-B*5801（B*58）則可能是保護基因。

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（張蕾編輯）

Association between HLA-B allelic polymorphism and type 2 diabetes mellitus in Han ethnicity of Jiangsu*

Ling-zhi Xia1,Peng Chao1,Xiao-e Li2,Tao Xu2,Khawar Ali Shahzad2,Yuan Mao1,Hou-zhi Zhang1,Chuan-lai Shen2
(1.Department of Laboratory Medicine,Nanjing KingMed Diagnostics Limited Company,Nanjing,Jiangsu 210002,China; 2.Department of Pathogen Biology and Immunology,Medical School of Southeast University,Nanjing,Jiangsu 210009,China)

Abstract:Objective To explore the association of HLA-B allele polymorphism with type 2 diabetes mellitus (T2DM) in Han ethnicity of Jiangsu region.Methods One hundred and eighteen patients with clinically diagnosed T2DM were examined.HLA-B typing was performed using polymerase chain reaction with sequence -based genotyping (PCR-SBT).The frequency of HLA-B alleles and serotypes in the group with T2DM was compared with that in Han ethnic healthy populations (644 persons and 20248 persons) from Jiangsu branch of Chinese National Marrow Donor Program (CMDP).Results Compared with the healthy donors,there was an increased frequency of HLA-B *1501 (8.90% vs 3.03%,Pc=0.000,statistical power = 98.23%) and a decreased frequency of HLA-B *5801 (1.69% vs 8.62%,Pc= 0.000,95% CI = 0.07-0.50,statistical power = 91.07%) in the group with T2DM.Accordingly,a higher frequency of HLA-B *15 serotype (21.18% vs 13.03%,Pc= 0.022,and a lower frequency of HLA-B*58book=38,ebook=43serotype (1.69% vs.8.62%,Pc= 0.000,= 0.18,95% CI = 0.07-0.50,power = 91.09%) were found in the T2DM group.Conclusions HLA-B*1501 allele may be a marker of susceptibility for T2DM,in reverse,HLA-B*5801 allele is possibly associated with a resistant effect on T2DM in Han ethnicity of Jiangsu region.These data suggest,for the first time,the association of HLA class I genes with the T2DM in Chinese population.

Keywords:type 2 diabetes; HLA-B; allelic polymorphism; PCR-SBT

[通信作者]沈傳來，E-mail：chuanlaishen@seu.edu.cn；Tel：13776629706；025-83272454

*基金項目：江蘇省科技廳科技支撐計劃項目資助（No：BE2012739）

收稿日期：2015-11-04

文章編號：1005-8982（2016）06-0037-08

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.009

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A