李 蓮 馬國(guó)強(qiáng) 劉 麗 劉安榮 師 婧 周杰瓏 王秀艷

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224；2.國(guó)家林業(yè)局昆明勘察設(shè)計(jì)院，云南昆明650216；3.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；4.昆明動(dòng)物園，云南昆明650224）

昆明動(dòng)物園圈養(yǎng)長(zhǎng)臂猿糞便可培養(yǎng)細(xì)菌分析

李 蓮1馬國(guó)強(qiáng)2劉 麗3劉安榮4師 婧4周杰瓏1王秀艷1

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224；2.國(guó)家林業(yè)局昆明勘察設(shè)計(jì)院，云南昆明650216；3.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明650224；4.昆明動(dòng)物園，云南昆明650224）

以昆明動(dòng)物園7只圈養(yǎng)長(zhǎng)臂猿為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)微生物檢測(cè)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，對(duì)其新鮮糞便可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定與分析。結(jié)果表明：分離得到的15株細(xì)菌中，有9株細(xì)菌可鑒定到種，分別屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、海氏腸球菌、耐鹽短桿菌和弗氏志賀菌4個(gè)種；有6株細(xì)菌可以鑒定到屬，分別屬于奈瑟菌屬和大腸桿菌2個(gè)屬；其中優(yōu)勢(shì)菌為耐鹽短桿菌和大腸桿菌。

長(zhǎng)臂猿；糞便；細(xì)菌；優(yōu)勢(shì)菌；動(dòng)物園

長(zhǎng)臂猿作為我國(guó)國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，與黑猩猩（Pan trog lodytes）、猩猩（Pongo pygmaeus）和大猩猩（Gorilla beringei）同屬類(lèi)人猿。雖然我國(guó)政府在20世紀(jì)80年代初設(shè)立多個(gè)保護(hù)區(qū)對(duì)長(zhǎng)臂猿進(jìn)行保護(hù)，但保護(hù)現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。目前我國(guó)的長(zhǎng)臂猿保護(hù)工作迫在眉睫。白掌長(zhǎng)臂猿（Hylobates lar）可能已經(jīng)從中國(guó)消失；東黑冠長(zhǎng)臂猿（Nomascus nasuts）和海南長(zhǎng)臂猿（Nomascus hainanus）的數(shù)量均不足30只，已接近滅絕邊緣；東白眉長(zhǎng)臂猿（Hoolock leuconedys）數(shù)量不足200只；即使是數(shù)量最多的西黑冠長(zhǎng)臂猿（Nomascus concolor），也僅有1 000多只［1］。在遷地保護(hù)中，患病死亡是長(zhǎng)臂猿數(shù)量減少一個(gè)不可忽視的因素，人工圈養(yǎng)常出現(xiàn)長(zhǎng)臂猿幼子腹瀉致死的情況，且這種情況一旦發(fā)生，無(wú)法治愈。究其原因，可能是關(guān)于長(zhǎng)臂猿的腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成還有待了解，當(dāng)遇到腸道菌群紊亂導(dǎo)致腹瀉時(shí)，一味地采用家養(yǎng)動(dòng)物的治療方式和藥物，達(dá)不到“對(duì)癥下藥”，自然就無(wú)療效可言。在對(duì)動(dòng)物腸道菌群研究中，常規(guī)方法容易忽略了不可培養(yǎng)微生物，分析時(shí)往往低估了腸道菌群的多樣性，很難全面反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征［2-3］。

近年來(lái)，基于16S rRNA建立的一系列分子生物學(xué)分析方法，對(duì)多種動(dòng)物腸道微生物的分析研究已有報(bào)道，但關(guān)于傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)結(jié)合對(duì)長(zhǎng)臂猿腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究較少。為此，本研究通過(guò)對(duì)昆動(dòng)物園7只長(zhǎng)臂猿鮮糞便進(jìn)行可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定與分析，初步分清種類(lèi)和數(shù)量，確定優(yōu)勢(shì)菌。研究結(jié)果可為今后其健康狀況監(jiān)測(cè)，以及腸道微生態(tài)制劑等深入研究提供參考，為指導(dǎo)長(zhǎng)臂猿等野生動(dòng)物正確防治腹瀉類(lèi)腸道疾病方面提供借鑒，提高遷地保護(hù)成效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源

長(zhǎng)臂猿7只，由昆明動(dòng)物園飼養(yǎng)，具體情況見(jiàn)表1。

表1 昆明動(dòng)物園長(zhǎng)臂猿情況Tab.1 Gibbons cases in Kunming zoo

1.2 試驗(yàn)試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基，均參照文獻(xiàn)［4］準(zhǔn)備；革蘭氏染色液、MR試劑、VP試劑等均按常規(guī)方法配制；基因組DNA快速提取試劑盒，蛋白酶K，瓊脂糖等購(gòu)自北京百泰克生物有限公司；Tris-base，EDTA，冰乙酸，無(wú)水乙醇等常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采樣 糞便采集時(shí)間為春夏秋3個(gè)季節(jié)的早、中、晚，每個(gè)季節(jié)采樣2次。每次采集時(shí)均用滅過(guò)菌的竹簽或是筷子取新鮮糞便20 g立刻裝入無(wú)菌采樣袋中，放入裝有冰袋的采樣盒保存，于30 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品的稀釋、培養(yǎng)等處理。

1.3.2 稀釋與培養(yǎng) 將采集的樣品稱5 g放入裝有45mL稀釋液的錐形瓶中，并放入搖床上30min，37℃，稀釋度為10-1。從錐形瓶中吸取樣品100μL注入盛有900μL無(wú)菌水的離心管中，吹打均勻。重復(fù)以上步驟，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等各種稀釋度。

分別吸取15μL 10-4、10-5、10-6稀釋后的菌液放入配置好的LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂布均勻；分別吸取15μL 10-3、10-4、10-5稀釋后的菌液放入配置好的EC培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂布均勻。每種培養(yǎng)基上接種3個(gè)培養(yǎng)皿，并設(shè)1個(gè)空白對(duì)照。所有操作均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，涂布完成后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 計(jì)數(shù) 取菌落數(shù)在30～300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，若只有1個(gè)稀釋度的菌落數(shù)符合此范圍，即以該菌落數(shù)記錄；若有2個(gè)稀釋度的菌落數(shù)符合，則由兩者菌落數(shù)的比值來(lái)決定，比值≤2應(yīng)記錄其平均數(shù)，若＞2則記錄其中菌落數(shù)較少的值；若3個(gè)稀釋度的菌落數(shù)均為30～300個(gè)，則樣品應(yīng)重新進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，直至只有1個(gè)或2個(gè)稀釋度菌落數(shù)在此范圍內(nèi)；若所有稀釋度的菌落數(shù)均＞300個(gè)，則按稀釋度最高的菌落數(shù)記錄；若所有稀釋度的菌落數(shù)均＜30個(gè)，則按稀釋度最低的菌落數(shù)記錄；若所有稀釋度的菌落數(shù)均不在30～300個(gè)之間，其中1個(gè)稀釋度＞300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度＜30個(gè)，則以接近30個(gè)或300個(gè)的菌落數(shù)記錄。

1.3.4 細(xì)菌分離與鑒定

1）細(xì)菌分離。根據(jù)細(xì)菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)平板中菌落的生長(zhǎng)表現(xiàn)，即菌落的大小、形狀、顏色、邊緣、表面隆起、光滑度、透明度等性狀，將相同的菌落歸為一類(lèi)，并統(tǒng)計(jì)出該菌落在所有樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，由此確定優(yōu)勢(shì)菌。并從平板中挑取各典型生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2）細(xì)菌染色鑒定。對(duì)分離的細(xì)菌純培養(yǎng)物首先進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的形狀、大小等革蘭氏染色特征，再用芽胞染色法，鞭毛染色法觀察細(xì)菌的芽胞、鞭毛，對(duì)分離細(xì)菌作出初步鑒定和分類(lèi)。

3）細(xì)菌生化鑒定。根據(jù)上述初步鑒定結(jié)果，針對(duì)不同的菌株選擇相應(yīng)的生化試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)，最后查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》將細(xì)菌鑒定到屬、種［5］。

1.3.5 16S rDNA序列分析 對(duì)生理生化鑒定的可疑菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析［6］，即進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，然后在EzBioCloud中的微生物核酸基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定細(xì)菌菌株種屬關(guān)系。細(xì)菌16S rDNA通用引物為：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（引物送上海生工合成）。

1）細(xì)菌16S rDNA提取。取0.5～2.0 m L培養(yǎng)菌液，按北京百泰克公司的基因組DNA快速提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因DNA.

2）PCR擴(kuò)增。在超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Namedrop ND-2000）測(cè)定DNA濃度后，選取適合的樣品作為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中2×Master Mix 25μL，上下游引物各1.5μL，模板3μL，加水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃45 s，57℃45 s，72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，30 min后于凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從長(zhǎng)臂猿糞便中分離出的細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中形成的菌落外觀形態(tài)差異不大，均是菌落邊緣整齊，濕潤(rùn)光滑，僅顏色有細(xì)微差別。如在NA培養(yǎng)基中形成的菌落顏色呈白色，在LB培養(yǎng)基上形成的菌落透明稍帶些許黃色，而在EC培養(yǎng)基中形成的菌落顏色則呈乳白色。

各培養(yǎng)基對(duì)照組上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，從而排除了在試驗(yàn)操作和培養(yǎng)過(guò)程中被污染的可能性。從以上不同培養(yǎng)基上挑取各典型生長(zhǎng)的菌落，在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)劃線分離，直到獲得純菌株，最終得到15株。

2.2 顯微鑒定

對(duì)15株分離細(xì)菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行顯微鑒定，包括革蘭氏染色、芽孢染色及莢膜染色，染色結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，長(zhǎng)臂猿糞便中分離得到的細(xì)菌以桿菌為主，排列形式有單個(gè)排列，成對(duì)排列，還有成對(duì)排列呈弧狀的菌株，分離得到的菌株僅有CBY-2為球菌，分離菌株的顯微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

另外，得到的15株細(xì)菌中，除CBY-1及CBY-5有芽孢，其余菌株的染色結(jié)果均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)芽孢。所有菌株均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在莢膜。

表2 分離菌株染色鑒定Tab.2 Identification of isolated strain

2.3 生化鑒定

選取有代表性的15株分離菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行各項(xiàng)生化試驗(yàn)，鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各分離菌株生化鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification results of different isolates

由表3可知：菌株CBY-4，CBY-5利用糖的特性以及甲基紅試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)結(jié)果等特征相似，可初步確認(rèn)為屬同一菌屬。另外CBY-6、CBY-7、CBY-8、CBY-9及CBY-10利用糖的特性和各生化特征也基本一致，也可將其初步歸為同一類(lèi)菌。其他8株菌株的生化特征存在差異，可能分屬為不同的菌種。

2.4 分子鑒定與分析

2.4.1 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增 利用細(xì)菌通用引物27（F）和1492（R）進(jìn)行糞便細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，CBY1～CBY13結(jié)果均得到預(yù)期的1 500 bp單一擴(kuò)增條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4.2 細(xì)菌16S rDNA序列分析 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，通過(guò)DNAMAN拼接，然后提交到EzTaxon（http：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行16S rDNA在線比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

一般認(rèn)為，相似度大于99%的細(xì)菌判定為同種細(xì)菌，相似度為95%～99%則判定為同屬，相似度在91%～95%判定為同科［7］。

表4 細(xì)菌16S rDNA比對(duì)結(jié)果Tab.4 Results of rDNA 16S

從表4可以看出，15株細(xì)菌，有9株細(xì)菌可鑒定到種，分別屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）、耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）和弗氏志賀菌（Shigella flexneri）4個(gè)種；另外6株細(xì)菌則可分別屬于奈瑟菌屬（Neisseria）和埃希氏菌屬（Escherichia）2個(gè)屬。

2.5 優(yōu)勢(shì)菌分析

通過(guò)菌落計(jì)數(shù)，確定優(yōu)勢(shì)菌群，結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可以看出：長(zhǎng)臂猿糞便分離出的菌株數(shù)量由高到低依次為耐鹽短桿菌、埃希氏菌屬菌、奈瑟菌屬菌、弗氏志賀菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，最后為海氏腸球菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為耐鹽短桿菌和大腸桿菌，分別占可培養(yǎng)細(xì)菌的50.52%和40.07%。

表5 長(zhǎng)臂猿糞便可培養(yǎng)細(xì)菌分離比例Tab.5 The segregation ratio of gibbons fecal bacteria

3 結(jié)論與討論

關(guān)于長(zhǎng)臂猿腸道細(xì)菌的研究前人工作較少，國(guó)外只有少數(shù)幾篇相關(guān)報(bào)道，如L.D.Banish等對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物腸道病原體中的痢疾菌-志賀氏菌進(jìn)行了報(bào)道研究，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)中的長(zhǎng)臂猿均有所感染［8］；Depaliand等對(duì)長(zhǎng)臂猿死因研究中發(fā)現(xiàn)類(lèi)圓線蟲(chóng)病能引起其腹瀉［9］。國(guó)內(nèi)李婉平等對(duì)廣州動(dòng)物園一例水樣瀉致死的白眉長(zhǎng)臂猿進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)其存在溶組織阿米巴感染［10］。施新泉等發(fā)現(xiàn)有長(zhǎng)臂猿感染司氏伯特絳蟲(chóng)?。?1］。劉燕等從一白頰長(zhǎng)臂猿體內(nèi)分離得到1株肺炎克雷伯氏菌［12-13］。李達(dá)等研究發(fā)現(xiàn)貴州一野生動(dòng)物園長(zhǎng)臂猿存在有流感病毒，支原體及巴氏桿菌的混合感染［14］。楊云飛等從一慢性腹瀉的白眉長(zhǎng)臂猿糞便中分離得到1株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種和1株致病性大腸桿菌［15］，且證實(shí)了長(zhǎng)臂猿腹瀉正是由于這2種菌混合感染引起的。

本試驗(yàn)依據(jù)可培養(yǎng)細(xì)菌菌落特征、染色特性和顯微形態(tài)觀察，以及結(jié)合16S rDNA序列分析等方法［16］，從核酸的角度揭示了長(zhǎng)臂猿腸道細(xì)菌的多樣性。對(duì)昆明動(dòng)物園7只健康長(zhǎng)臂猿糞便可培養(yǎng)細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽(yáng)性菌數(shù)量多于革蘭氏陰性菌，共計(jì)分離出耐鹽短桿菌、大腸桿菌、奈瑟菌、弗氏志賀菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、海氏腸球菌共6種。與楊云飛等分離得到肺炎克雷伯氏菌和致病性大腸桿菌有一定差異。也許是因?yàn)闂钤骑w等是從正在腹瀉的長(zhǎng)臂猿糞便中分離得到的，與本試驗(yàn)采集的沒(méi)有病癥的長(zhǎng)臂猿糞便有一定差異。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，一些腸道菌群常見(jiàn)菌未能檢出，可能與該試驗(yàn)所選用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法有關(guān)，但在一定程度上，該結(jié)果仍可作為長(zhǎng)臂猿腸道菌群數(shù)值的參考。

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（責(zé)任編輯 張 坤）

Research and Analysis of Cultivate Bacteria in Captive Gibbons Faeces in the Kunming Zoo

Li Lian1，Ma Guoqiang2，Liu Li3，Liu Anrong4，Shi Jin4，Zhou Jielong1，Wang Xiuyan1
（1.College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.Chian Forest Exploration&Design Institute on Kunming，Kunming Yunnan 650216，China；3.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；4.Kunming Zoo，Kunming Yunnan 650224，China）

It took seven captive Gibbons of Kuming Zoo as the research object，adopted a combination of traditionalmicrobiological and molecular biologicalmethods，isolated，identified and analyzed the cultivate bacteria of fresh feces.The results showed that nine strains could identify to spicies among the 15 isolated strains of bacteria，which were belonged to Bacillusmethylotrophicus，Enterococcushirae，Brevibacterium halotolerans and Shigella flexneri 4 species，respectively.The other six strains could identify to genus，which were belonged to the genus Neisseria and Escherichia coli2 genus，respectively.Which the brevibacterium halotolerans and Escherichia coli were the dominantbacteria.

gibbons；faeces；bacteria；dominant bacteria；zoo

S718.6

A

2095-1914（2016）02-0121-06

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.020

2015-10-12

云南省生物學(xué)優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）資助；林下生物資源保護(hù)與利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（51400605）資助。

第1作者：李蓮（1990—），女，碩士生。研究方向：動(dòng)物疫原疫病。Email：15008189120@163.com。

周杰瓏（1976—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：動(dòng)物繁殖與疾病研究。Email：zhjiel@163.com。