王佳胡晞袁鵬鄧永兵

·論 著·

鋅指蛋白403對人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

王佳*胡晞*袁鵬*鄧永兵*

目的 研究鋅指蛋白403（gametogenetin-binding protein 2，GGNBP2）表達(dá)水平對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，侵襲，遷移能力的影響。方法 培養(yǎng)人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GGNBP2的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，qRT-PCR及Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效率；CCK8檢測細(xì)胞細(xì)胞增殖能力；Transwell小室法檢U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力變化；Western Blot檢測AKT,p-AKT,PCNA,MMP9表達(dá)水平的改變。結(jié)果 成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GGNBP2的人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，與對照組和空載組比較，過表達(dá)組細(xì)胞增殖（P＜0.05），侵襲力（57± 6 vs.203±6，205±7，F(xiàn)=512.4，P＜0.05），遷移力(74±7 vs.254±14，248±13，F(xiàn)=242.5，P＜0.05）明顯抑制;Western Blot結(jié)果顯示，與對照組和空載組比較，過表達(dá)組p-AKT(F=45.4,P＜0.05)，PCNA(F=348.5,P＜0.05)，MMP9(F= 88.7,P＜0.05)表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論 GGNBP2可能通過抑制AKT的磷酸化水平，并經(jīng)過相應(yīng)的信號(hào)通路下調(diào)PCNA，MMP9表達(dá)水平，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，侵襲和遷移，提示GGNBP2可能成為膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

GGNBP2膠質(zhì)瘤 增殖 侵襲 遷移

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤45%，患者中位生存期不足1年[1-3]。鋅指蛋白403（Gametogenetin-binding protein 2，GGNBP2），定位于17q12～17q21.1,該區(qū)位于乳腺癌，前列腺癌和喉癌等腫瘤的遺傳易感區(qū)域內(nèi)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GGNBP2在多種正常組織內(nèi)高表達(dá)，而在腫瘤中低表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4,5]；然而，GGNBP2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用如何?本研究旨在探討GGNBP2對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用以及相關(guān)機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)加入青霉素-鏈霉素混合液（1：100），37℃、5%CO2的恒溫孵箱中常規(guī)培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分3組：①以未感染病毒的U251細(xì)胞為空白對照組（對照組）；②以感染陰性對照慢病毒LV-NC（上海吉?jiǎng)P基因）的U251細(xì)胞為陰性對照組（空載組）；③以感染重組慢病毒LV-GGNBP2（上海吉?jiǎng)P基因）的U251細(xì)胞為GGNBP2上調(diào)組（過表達(dá)組）。將U251細(xì)胞接種于6孔板中，5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后，分別加入感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為40的重組慢病毒LV-NPRL2和陰性對照慢病毒LV-NC，同時(shí)加入5.0μg/mL的Polybrene。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，換新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。通過2.0μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測U251中GGNBP2過表達(dá)效率 在對數(shù)期收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。按說明書（Takara）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)。GGNBP2基因的上游引物序列為5'-TTATGAAGGCTTGCGGTGCT-3',下游引物序列為5'-ATGCCTTTCTCTTCGCCCTC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為123 bp（大連寶生物）；內(nèi)參照GADPH基因的上游引物序列為5'-ACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，下游引物序列為5'-ATACCAGGAAATGAGCTTGA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長度為173 bp（大連寶生物）。PCR反應(yīng)條件：95℃變性30s；95℃15 s, 60℃45s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示GGNBP2 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.4 蛋白免疫印跡檢測U251中GGNBP2過表達(dá)后相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，根據(jù)說明書提取細(xì)胞總蛋白。將各組蛋白于10%SDS-PAGE凝膠中電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫下封閉1 h；一抗孵育過夜；TBST漂洗后，孵育二抗1 h（山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，均為(1：5000）；TBST洗膜后用超敏ECL試劑發(fā)光顯色，采集圖像。各蛋白一抗稀釋比例如下：GGNBP2 1：500（Sigma）、GAPDH 1：1000（碧云天）、p-Akt1 1：250（Cell Signaling Technology），Akt1 1：1000（Cell Signaling Technology），MMP-9 1：500（Abcam）、PCNA 1：500(Abcam)。

1.5 CCK8檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞接種于96孔板中，2000個(gè)/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96h后，加入CCK-8試劑（上海碧云天）（10μL/孔），37℃反應(yīng)1 h后，檢測450nm波長處各孔的吸光度（OD）值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲和遷移 在孔徑為8μm的小室內(nèi)鋪用無血清DMEM稀釋的基質(zhì)膠（基質(zhì)膠：DMEM溶液=1：5）；取指數(shù)生長期的各組細(xì)胞，將濃度為1.25×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液400μL細(xì)胞種入上室，下室加入含10%血清DMEM 600μL；培養(yǎng)20h后，取出小室，PBS洗滌，棉簽拭去小室上層未穿出細(xì)胞和基質(zhì)膠，固定并染色。遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)方法和步驟基本相同，差別在于上室不鋪基質(zhì)膠，上室種入細(xì)胞后常規(guī)培養(yǎng)7 h。觀察照相，按每組不少于5個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)穿出細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用SPSS17.0對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效率 建立穩(wěn)定過表達(dá)GGNBP2的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測GGNBP2 mRNA水平：對照組、空載組及過表達(dá)組中mRNA（1，0.86± 0.07,2.50±0.20，F(xiàn)=160.8，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較顯示，過表達(dá)組mRNA水平明顯高于空載組（P＜0.05）及對照組（P＜0.05），對照組與空載組mRNA無明顯差異（P＞0.05）。Western Blot顯示對照組、空載組及過表達(dá)組中蛋白水平（1，0.97±0.08,2.27±0.19，F(xiàn)=119.3，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較顯示：過表達(dá)GGNBP2組蛋白水平較空載組（P＜0.05）和對照組明顯提高（P＜0.05），而對照組與空載組mRNA無明顯差異（P＞0.05）。見表1，圖1。

2.2 GGNBP2的過表達(dá)抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖 運(yùn)用CCK8增殖試劑盒檢測GGNBP2對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力影響，結(jié)果顯示：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)值分別為25.7,139.2,108.3,101.3(P＜0.05),進(jìn)一步多重比較顯示，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)組增殖明顯低于空載組(P＜0.05)與對照組（P＜0.05）；而空載組和對照組之間的增殖能力無明顯差異（P＞0.05），見表2。

2.3 GGNBP2的過表達(dá)抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移 使用Transwell小室法檢測U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化，結(jié)果顯示：對照組、空載組及過表達(dá)組細(xì)胞數(shù)（侵襲：203±6，205±7，57±6，F(xiàn)=512.4，P＜0.05；遷移：254±14，248±13，74±7，F(xiàn)=242.5，P＜0.05）。進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，與對照組和空載組相比，過表達(dá)組細(xì)胞穿過人工基底膜Matrigel膠和微孔膜的數(shù)目顯著減少，侵襲（P＜0.05）和遷移（P＜0.05）能力均明顯降低，而空載組與對照組侵襲（P＞0.05）和遷移（P＞0.05）能力無明顯差異；以上結(jié)果表明GGNBP2能夠顯著抑制U251細(xì)胞的侵襲能力。此外，GGNBP2對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響與侵襲能力相一致，也能夠抑制U251細(xì)胞的遷移能力（表3，圖2）。

表1 U251過表達(dá)GGNBP2 mRNA和蛋白改變

表2 GGNBP2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響（CCK8法）

圖1 Western Blot檢測GGNBP2過表達(dá)

2.4 GGNBP2的沉默降低PCNA、MMP9和PAKT的表達(dá)水平 結(jié)果顯示，對照組，空載組及過表達(dá)組PCNA(F=348.5,P＜0.05)、MMP9(F=88.7,P＜0.05)表達(dá)具有明顯差異，進(jìn)一步多重比較顯示，過表達(dá)組的PCNA和MMP9水平較空載組（P＜0.05）和對照組（P＜0.05）明顯降低，而空載組與對照組之間無明顯差異（P＞0.05）；同樣，我們檢測了PAKT表達(dá)情況，對照組，空載組及過表達(dá)組PAKT水平具有明顯差異(F=45.4,P＜0.05)，多重比較顯示過表達(dá)組的P-AKT表達(dá)水平較對照組（P＜0.05）與空載組（P＜0.05）明顯降低，空載組與對照組之間無明顯差異（P＞0.05）。見表4，圖3。

圖2 GGNBP2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移。上圖：GGNBP2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲；下圖：GGNBP2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移（100×）

圖3 GGNBP2過表達(dá)抑制P-AKT,PCNA和MMP9

表3 GGNBP2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響

3 討論

GGNBP2定位于17q12～17q21.1,該區(qū)位于乳腺癌，前列腺癌和喉癌等腫瘤的遺傳易感區(qū)域內(nèi), 2869bp，含有14個(gè)外顯子，編碼序列位置為317-2410，編碼一個(gè)包含696個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。既往研究顯示GGNBP2可以抑制宮頸癌的增殖，遷移和侵襲[4]。在膠質(zhì)瘤中尚未見GGNBP2相關(guān)報(bào)道，其分子功能是否影響膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為并不清楚。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，是影響患者預(yù)后和存活的關(guān)鍵。因此，本課題組選用常見的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對象，成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GGNBP2的U251細(xì)胞株；通過CCK8和Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GGNBP2過表達(dá)可以明顯抑制U251細(xì)胞增殖，遷移和侵襲（圖2）；PCNA是Kononen等首先發(fā)現(xiàn)并命名,是一種小分子的核蛋白，與細(xì)胞DNA的合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖過程中起重要作用,是評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)[6].基質(zhì)金屬蛋白(matrix metalloporteinases,MMPs)是高度保守的一類酶,多以酶原形式分泌,可以特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)中的一種或幾種蛋白質(zhì)，MMPs降解ECM是腫瘤細(xì)胞向瘤灶周圍侵襲性生長的關(guān)鍵事件，其中MMP9與膠質(zhì)瘤的侵襲性生長關(guān)系尤為密切。本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)GGNBP2可以明顯抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株內(nèi)PCNA和MMP9的表達(dá)，與細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)相一致，進(jìn)一步證實(shí)GGNBP2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。

既往研究表明AKT信號(hào)通路在多種腫瘤中被激活，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。在膠質(zhì)瘤中AKT信號(hào)通路激活后可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖，遷移和侵襲[8]，因此推測GGNBP2是否可以抑制AKT信號(hào)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，故我們通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)GGNBP2可以明顯抑制AKT磷酸化水平，導(dǎo)致AKT信號(hào)通路失活，證實(shí)GGNBP2可能通過AKT信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。

綜上所述，GGNBP2在膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲多個(gè)病理環(huán)節(jié)中均發(fā)揮重要作用，有望成為膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)。然而，有關(guān)GGNBP2在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的研究報(bào)道并不多見。因此，GGNBP2在膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲過程中的具體分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]吳勁松,毛穎.腦膠質(zhì)瘤手術(shù)理念和研究熱點(diǎn)[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2009,35(6)：376-379.

[2]TU Y,GAO X,Li G,et al.MicroRNA-218 inhibits glioma invasion,migration,proliferation,and cancer stem-like cell self-renewal by targeting the polycomb group gene Bmi1[J].Cancer Research,2013,73(19)：6046-6055.

[3]JOHNSON DR,O'NEILL BP.Glioblastoma survival in the United States before and during the temozolomide era[J].Journal of Neuro-Oncology,2012,107(2)：359-364.

[4]LAN ZJ,HU Y,ZHANG S,et al.GGNBP2 acts as a tumor suppressor by inhibiting estrogen receptor α activity in breast cancer cells[J].Breast Cancer Research&Treatment,2016,158：263-276.

[5]STUART H,VANOOSTEN A,RADZISHEUSKAYA A,et al. NANOG Amplifies STAT3 Activation and They Synergistically Induce the Naive Pluripotent Program.Current Biology Cb 2014,24(3)：340-346.

[6]許州，袁先厚，江普查，等.Aurora A,PCNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010(02)：227-229.

[7]秦麗娟，賈永森，趙喜慶，等.鴉膽子油乳注射液對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響及可能機(jī)制[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2016,47(3)：347-350.

[8]KOSEOGLU S,LU Z,KUMAR C,et al.AKT1,AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-specific and knockdown of all three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines[J]Cancer Biology&Therapy,2007,6 (5)：755-762.

The effect and mechanism of GGNBP2 regulates the proliferation,invasion and migration of human U251glioma cells.

WANG Jia,HU Xi,YUAN Peng,DENG Yongbing.Department of Neurosurgery,The Emergency Medical Center of Chongqing,Chongqing 400016,China.Tel：023-63692117.

Objective To investigate the effects of GGNBP2 on proliferation，migration and invasion of human glioma U251 cells and the potential mechanism.Methods U251 glioma cells were transfected with lentiviral vector carrying GGNBP2 to establish a stable overexperssion of GGNBP2 in U251 cell line.After verification of the efficiency of transfection by real-time PCR,Western Blot,PCR and CCK-8 were applied to detect the proliferation of U251 cells.The Transwell chamber assay was applied to measure the migration and invasion of human U251 glioma cells.Western blot was applied to measure protein levels of AKT,p-AKT,PCNA and MMP9.Result The stable U251 glioma cell line overexpressing GGNBP2 was successfully established.Compared with the control group,overexpression of GGNBP2 significantly inhibited the proliferation（P＜0.05），invasion（57±6 vs.203±6，205±7，F(xiàn)=512.4，P＜0.05）and migration(74±7 vs. 254±14，248±13，F(xiàn)=242.5，P＜0.05）of U251 cells.The protein expression levels of p-AKT(F=45.4,P＜0.05),PCNA (F=348.5,P＜0.05)and MMP-9(F=88.7,P＜0.05)in GGNBP2 group were markedly decreased compared with the control group.Conclusion GGNBP2 may suppress the proliferation,invasion and migration of glioma though down-regulation of p-AKT,which in turn inhibits PCNA and MMP-9 expression.

G GNBP2 Glioma Proliferation Invasion Migration

R739.41

A

2016-10-31）

（責(zé)任編輯：甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.12.002

*重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)外科（重慶 400014）

（E-mail：sdwangjia@163.com）