蘭艷麗　劉　韻

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院

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光動(dòng)力學(xué)調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑對(duì)人宮頸癌的治療機(jī)制

蘭艷麗劉韻

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討在宮頸癌中光動(dòng)力學(xué)調(diào)控對(duì)miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑的影響，為光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143應(yīng)用于宮頸癌的治療機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法人宮頸癌HeLa細(xì)胞分別進(jìn)行miR143干擾處理(miR143組)、光動(dòng)力照射處理(PDT組)及miR143干擾聯(lián)合光動(dòng)力照射處理(PDT+ miR143組)，采用CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell小室侵襲模型對(duì)各組處理后HeLa細(xì)胞的抑制率、凋亡率及侵襲能力進(jìn)行分析，同時(shí)采用熒光定量PCR檢測不同處理前后各組細(xì)胞的miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果3組之間的細(xì)胞抑制率、凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PDT+ miR143組細(xì)胞抑制率和凋亡率分別高于PDT組和miR143組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PDT+ miR143組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于miR143組和PDT組(P<0.05)。處理后，3組miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較處理前均顯著升高(P<0.0001)，且處理后PDT+ miR143組miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于PDT組和miR143組(P<0.05)，而處理后3組Bax mRNA表達(dá)水平無明顯變化。結(jié)論在宮頸癌中，光動(dòng)力學(xué)治療對(duì)miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑起正向調(diào)控作用，為光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143治療宮頸癌的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】光動(dòng)力學(xué)；miR143；Bcl-2/Bax；宮頸癌

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:541～544)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率位于女性癌癥的第二位，全世界約有100萬女性患有宮頸癌[1-2]。自70年代中期光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)在生殖器皰疹得到應(yīng)用之后，光動(dòng)力學(xué)療法就成為臨床上治療腫瘤的重要方法，由于其創(chuàng)傷小、毒性低、可重復(fù)治療并能保護(hù)器官和患者的生理功能等優(yōu)勢，光動(dòng)力學(xué)療法在宮頸癌治療中得到廣泛的應(yīng)用[3-4]。miR143是一類不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA,近幾年的研究顯示miR143與食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[5-6]。目前，miR143應(yīng)用于癌癥的治療已成為研究的熱點(diǎn)。關(guān)于光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143的抗腫瘤作用未見報(bào)道，鑒于此，本研究將對(duì)光動(dòng)力學(xué)療法調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑進(jìn)行研究，以期為光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143治療宮頸癌奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞購于上海博研生物工程研究中心，TMPyP4、DMED、胚胎牛血清、RNAi轉(zhuǎn)染試劑、TransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒購于北京全式金有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、CCK8試劑盒、FITC-Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于索來寶生物技術(shù)有限公司，Transwell小室購于北京優(yōu)尼生物科技有限公司，matrigel基質(zhì)膠購于德國BD公司，QIAquick RNA Extraction Kit購于德國QIAGEN公司，F(xiàn)irst Strand cDNAsynthesis Kit試劑盒購于日本Takara公司。pGenesil-1-miR143質(zhì)粒載體由武漢晶賽公司構(gòu)建。流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、ABI7500熒光定量PCR儀均為本院實(shí)驗(yàn)中心提供，PDT激光治療儀由本院神經(jīng)外科提供。miR143、Bcl-2和Bax熒光定量引物由華大基因合成，miR143引物序列：F:5'-GCGCAGCGCCCTGTCTCCCAG-3';R:5'-GCTGCAGAACAACTTCTCTCTTC-3',Bcl-2:F:5'-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-3';R:5'-AGGACCAGGCCTCCAAGCT-3';Bax:F:5'-CCTTTTCTACTTTGCCAGCAAAC-3';R:5'-GAGGCCGTCCCAACCAC-3',GAPDH：F：5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’,R:5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組用含10%胚胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)子宮頸癌HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，每2天進(jìn)行換液或傳代處理。分別在種板36 h后進(jìn)行miR143干擾處理(miR143組)、光動(dòng)力照射處理(PDT組)及miR143干擾聯(lián)合光動(dòng)力照射處理(PDT+ miR143組)，以種板36 h后未做處理的子宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)照(空白對(duì)照組)，其中miR143濃度為100 nm/L,光動(dòng)力學(xué)處理中TMPyP4濃度為10F mol/L，激光波長為425 nm，激光能量密度為8 J/cm2,PDT+miR143組中中板18 h后先給予miR143干擾處理，培養(yǎng)18 h再進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)處理，作用時(shí)間均為6 h。

1.2.2各組細(xì)胞生長抑制率、凋亡率及侵襲能力檢測采用CCK8試劑盒檢測各組細(xì)胞生長抑制率，采用FITC-Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，具體操作按試劑盒說明，采用Transwell小室侵襲模型檢測各組細(xì)胞的侵襲性，具體操作參照文獻(xiàn)報(bào)道[7]。

1.2.3處理前后各組細(xì)胞miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平各組于處理前及處理作用后6 h收集細(xì)胞，采用QIAquick RNA Extraction Kit(購自QIAGEN公司,德國)，濃度及純度符合要求的RNA進(jìn)行合成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成按照First Strand cDNA synthesis Kit操作說明(Takara公司，日本)，反應(yīng)條件為：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一鏈放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用TransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行miR143、Bcl-2和Bax實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為：cDNA第一鏈1 μl,2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10 μM)0.6 μl,引物2(10 μM)0.6 μl,Passive Reference Dye 0.4 μl,ddH2O 7.4 μl，反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃10 sec；58 ℃20 sec；72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行溶解曲線的分析，程序?yàn)椋?0 ℃1 min;95 ℃30 s。在ABI7500分析軟件上分析miR143、Bcl-2和Bax、GAPDH基因(參考基因)的Ct值，采用2-?Ct法計(jì)算各組細(xì)胞處理前后miR143、Bcl-2和Bax的表達(dá)量，采用公式?Ct= Ct(目的基因)-Ct(GAPDH基因)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組子宮頸癌HeLa細(xì)胞生長抑制

CCK-8法檢測細(xì)胞生長抑制情況，PDT組、miR143組及PDT+ miR14 3組的細(xì)胞抑制率分別為(46.16±3.76)%、(28.34±4.05)%、(91.32±8.96)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PDT+ miR143組胞抑制率明顯高于PDT組和miR143組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組子宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及侵襲能力情況

空白對(duì)照組、PDT組、miR143組及PDT+ miR143組凋亡率差異明顯(P<0.05)，3組處理組凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，且PDT+ miR143組凋亡率明顯高于PDT組和miR143組(P<0.05)。各組侵襲能力的檢測結(jié)果，3組處理組穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，其中PDT+ miR143組穿膜細(xì)胞數(shù)與miR143組及PDT組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

±s)

2.3處理前后各組細(xì)胞miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平

處理前，miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平在3組之間均無明顯差異(P>0.05)。

經(jīng)PDT、miR143及聯(lián)合PDT+miR143處理，3組miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平較處理前均顯著升高(P<0.0001)，且處理后PDT+ miR143組miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于PDT組和miR143組(P<0.05)。處理后3組Bax mRNA表達(dá)水平有下降的趨勢，但與處理前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且處理后3組之間無明顯差別(P>0.05)，見表2。

3討論

光動(dòng)力療法(PDT)是建立在對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性的聚積吸收光敏劑，在進(jìn)行光照后，光敏劑通過光化學(xué)反

分組 miR143處理前處理后Bcl-2處理前處理后Bax處理前處理后PDT組2.21±1.124.32±0.971.97±1.254.56±1.194.12±1.214.02±1.06miR143組2.34±1.054.84±0.951.89±1.435.39±1.034.23±1.134.01±1.13PDT+miR143組2.14±1.085.71±0.871.74±1.196.47±0.914.19±1.084.06±1.08

應(yīng)將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的高度細(xì)胞毒性的單線態(tài)氧和其他活性氧，其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致組織的壞死或細(xì)胞的凋亡[8]。因光動(dòng)力療法對(duì)組織特異性較好，對(duì)健康組織損害小，引起的并發(fā)癥及不良反應(yīng)很少，因而為宮頸癌的治療提供了一種有效的方法。miRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成高度保守性的內(nèi)源非編碼RNA分子，近年來，miRNA已經(jīng)成為分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，不斷有研究指出，miRNA對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用[9]。miR143作為其中一種miRNA被指出與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可通過其靶向基因Bcl-2抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。基于光動(dòng)力療法和miR143對(duì)宮頸癌治療的意義，本研究將對(duì)光動(dòng)力學(xué)療法調(diào)控miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑進(jìn)行研究，以期為光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143治療宮頸癌奠定基礎(chǔ)。

本研究采用CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)及Transwell小室侵襲模型對(duì)進(jìn)行miR143處理、光動(dòng)力照射處理及miR143聯(lián)合光動(dòng)力照射處理后HeLa細(xì)胞的抑制率、凋亡率及侵襲能力分別檢測，結(jié)果顯示不同處理組之間的細(xì)胞生長抑制情況差異顯著(P<0.05)，其中miR143聯(lián)合光動(dòng)力照射處理的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)miR143或光動(dòng)力照射處理(P<0.05)，提示光動(dòng)力學(xué)和miR143可相互促進(jìn)各自抑制腫瘤細(xì)胞的作用。凋亡率檢測結(jié)果顯示處理組細(xì)胞的凋亡率顯著高于未處理細(xì)胞的凋亡率，且經(jīng)miR143聯(lián)合光動(dòng)力照射處理的細(xì)胞凋亡率明顯高于miR143或光動(dòng)力照射單獨(dú)處理(P<0.05)，提示光動(dòng)力學(xué)和miR143可相互促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用(P<0.05)。侵襲能力的結(jié)果顯示，處理組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于未處理組(P<0.05)，且經(jīng)miR143聯(lián)合光動(dòng)力照射處理的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于miR143或光動(dòng)力照射單獨(dú)處理(P<0.05)，提示miR143和光動(dòng)力均可阻礙腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，兩者的聯(lián)合能相互促進(jìn)各自抑制腫瘤細(xì)胞侵襲作用的發(fā)揮。同時(shí)，本研究采用熒光定量PCR對(duì)不同處理前后細(xì)胞的miR143、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示處理后細(xì)胞的miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.0001)，且miR143聯(lián)合光動(dòng)力照射的miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于miR143或光動(dòng)力照射單獨(dú)處理(P<0.05)，提示miR143和光動(dòng)力抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡及阻礙侵襲的作用的發(fā)揮與miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的上升有關(guān)，且兩者的聯(lián)合能協(xié)同促進(jìn)miR143和 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的上升。Bax mRNA表達(dá)水平有下降的趨勢，但與處理前相比，均無顯著性差異(P>0.05)，可能與光動(dòng)力學(xué)處理的時(shí)間、強(qiáng)度、波長及miR143的濃度有關(guān)。

綜上所述，在宮頸癌中，光動(dòng)力學(xué)治療對(duì)miR143激活Bcl-2/Bax的信號(hào)路徑起正向調(diào)控作用，為光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合miR143治療宮頸癌的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯：甘艷)

Regulation Effect of Photodynamic Therapy on Bcl-2/Bax Signal Path Activated by miR143 in Human Cervical Cancer

LANYanli,LIUYun.XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang,441021

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulation effect of photodynamic therapy on Bcl-2/Bax signal path activated by miR143 in human cervical cancer,and lay foundation for cervical cancer treated with photodynamic therapy along with miR143.MethodsHuman HeLa cells received miR143 interference(miR143 group),photodynamic irradiation treatment(PDT group) and miR143 interference combined with photodynamic irradiation(PDT + miR143 group).The rate of inhibition,apoptosis and invasion were detected by CCK8,flow cytometry and Transwell model,respectively.Meanwhile the expression levels of miR143,Bcl-2 and Bax before and after different treatments were detected by fluorescence quantitative PCR.ResultsThe inhibition rates and apoptosis rates among the 3 groups were significantly different(P<0.05),inhibition rates and apoptosis rates of PDT + miR143 group were distinctly higher than those of PDT group and miR143 group(P<0.05).And invasion cell number of PDT + miR143 group was significantly higher than that of miR143 group and PDT group(P<0.05).After treatment,the expression levels of miR143 and Bcl-2 among the 3 groups visibly increased than before treatment(P<0.0001).Moreover the expression levels of miR143 and Bcl-2 were significantly higher than those of PDT group and miR143 group(P<0.05).However the expression levels of Bax mRNA among the 3 groups showed no significant differences after treatment(P>0.05).ConclusionIn cervical cancer,photodynamic therapy upregulated the Bcl-2/Bax signal path activated by miR143,and lay foundation for cervical cancer treated with photodynamic therapy along with miR143.

【Key words】Photodynamic therapy；miR143；Bcl-2/Bax；Cervical cancer

(收稿日期2015-07-06修回日期 2015-12-10)

中圖分類號(hào)：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)04-0541-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.006

通訊作者：劉韻