孫國威 劉曉慶 楊蒙蒙 穆 寧（無錫加萊克色譜科技有限公司，無錫 214092）

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治療性抗體純化色譜填料

孫國威 劉曉慶 楊蒙蒙 穆 寧
（無錫加萊克色譜科技有限公司，無錫 214092）

孫國威，碩士，畢業(yè)于江南大學(xué)食品學(xué)院，后于無錫加萊克色譜科技有限公司工作至今，主要從事生物層析介質(zhì)應(yīng)用開發(fā)工作。

E-mail:guowei.sun@galak-tech.com

穆寧，1992年獲美國普渡大學(xué)化學(xué)博士學(xué)位。在普渡大學(xué)求學(xué)期間，師從世界著名液相色譜專家Fred Regnier教授，從事用于單克隆抗體分離的大孔聚苯乙烯微球液相色譜填料合成和表面化學(xué)研究，以及高純度球形多孔硅膠合成和表面化學(xué)研究，對(duì)世界著名的貫流色譜技術(shù)的發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。并先后在美國著名企業(yè)PerSeptive Biosystems、Applied Bisystems、Perkin Elmer、Vydac和W.R.Grace從事研發(fā)工作。2009年回國后組建了創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)，創(chuàng)辦了無錫加萊克色譜科技有限公司。

E-mail:ning.mu@galak-tech.com

以蛋白A親和色譜為核心的純化技術(shù)在治療性單抗工業(yè)生產(chǎn)中通常是第一個(gè)步驟。離子交換、疏水和混合型色譜技術(shù)作為精制手段也得到了廣泛應(yīng)用。文章以較短的篇幅簡單介紹了各種用于治療性單抗工業(yè)生產(chǎn)的色譜填料的特性和使用方法。

治療性單抗經(jīng)過近30年的發(fā)展，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)占據(jù)了舉足輕重的地位。像所有生物藥物一樣，它們必須經(jīng)過液相色譜純化。從現(xiàn)有的純化流程來看，可以分為由蛋白A親和色譜主導(dǎo)和由非蛋白A親和色譜組合兩個(gè)類別。毫無疑問，前者占據(jù)了統(tǒng)治性地位。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)主要?dú)w因于蛋白A親和色譜的高倍數(shù)純化效果。通常，大部分高分子量抗體分子聚集體、宿主細(xì)胞蛋白和蛋白A親和色譜填料產(chǎn)生的泄漏蛋白A、宿主細(xì)胞DNA均可在蛋白A親和色譜這一步除去，得到純度高達(dá)90%的單抗溶液，由于親和色譜本身所具備的濃縮效應(yīng)，所需處理的樣品體積也成倍地減小，這些都是有利于下面的精制色譜步驟的重要因素。大量使用親和色譜和它所帶來的巨大成功在生物制藥工業(yè)領(lǐng)域是一個(gè)創(chuàng)舉。但是業(yè)內(nèi)人士同時(shí)也指出：治療性單抗的工業(yè)生產(chǎn)上游技術(shù)的發(fā)展速度高于下游技術(shù)，使得下游純化成為整個(gè)流程的瓶頸。如何更加快速高效完成純化對(duì)蛋白A親和色譜填料的動(dòng)態(tài)載量（dynamic binding capacity，DBC）提出了更高要求。此外，蛋白A親和色譜填料價(jià)格很高，通常是其他色譜填料的10倍或更多，占了整個(gè)生產(chǎn)所需耗材成本的25%左右，這一點(diǎn)對(duì)發(fā)展中國家是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)在市場(chǎng)上各種品牌的色譜填料種類很多，容易讓使用者產(chǎn)生困惑。本文試圖將蛋白A親和色譜填料以及與之配套使用的色譜填料的基本使用范圍做一個(gè)梳理，供讀者參考。

1 蛋白A親和色譜填料

1.1 蛋白A配基

源于金黃色葡萄球菌（stapgylococcus aureus）細(xì)胞壁的天然蛋白A在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)。

1972年，科學(xué)家們發(fā)表了有關(guān)天然蛋白A的進(jìn)一步研究，揭示了它的結(jié)構(gòu)和對(duì)IgG分子的特異識(shí)別，并在此基礎(chǔ)上，首次提出了將天然蛋白A偶聯(lián)到色譜填料上制成親和色譜填料的概念①。天然蛋白A的分子量約為42 000Da，1977年的文獻(xiàn)報(bào)道了它的N端和C端功能迥異：在N端，存在4個(gè)結(jié)構(gòu)域（從N端起依次為D、A、B、C），每個(gè)結(jié)構(gòu)域約為7000Da，這些結(jié)構(gòu)域都具有與抗體分子Fc部分結(jié)合的能力；而C端的15 000Da的部分完全不具備Fc結(jié)合能力，其功能是使天然蛋白A分子能夠結(jié)合到金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁上②③。20世紀(jì)80年代，蛋白A的氨基酸序列全部揭曉，能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)蛋白A表達(dá)的基因克隆被首次發(fā)表④。同時(shí)，N端第5個(gè)Fc識(shí)別結(jié)構(gòu)域E也被發(fā)現(xiàn)⑤。這些堅(jiān)實(shí)的成果奠定了應(yīng)用基因工程方法規(guī)?；a(chǎn)蛋白A的基礎(chǔ)，美國Repligen公司首先實(shí)現(xiàn)了重組蛋白A的生產(chǎn)。20世紀(jì)90年代，美國FDA要求用于治療性單抗純化色譜填料采用的蛋白A配基不能與動(dòng)物源的任何分子產(chǎn)生接觸，這一要求改變了蛋白A的生產(chǎn)流程和純化方法?，F(xiàn)在，天然蛋白A已經(jīng)退出了治療性單抗純化色譜填料配基市場(chǎng)。另一個(gè)引起人們高度關(guān)注的研究結(jié)果是基因工程方法制成的具有耐堿結(jié)構(gòu)的蛋白A，它是由4個(gè)或5個(gè)改造過的B結(jié)構(gòu)域（叫做Z結(jié)構(gòu)域）組合制成。其中，對(duì)B結(jié)構(gòu)域中不穩(wěn)定的天冬酰胺-賴氨酸二肽改造為天冬酰胺-丙氨酸二肽⑥。這一成果奠定了在強(qiáng)堿條件下比較穩(wěn)定的蛋白A構(gòu)建的基礎(chǔ)，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)直接使用氫氧化鈉溶液作為在位清洗（clean-in-place，CIP）具有重大意義。有2個(gè)或多個(gè)C結(jié)構(gòu)域的蛋白A也是多個(gè)研究機(jī)構(gòu)和公司的研發(fā)對(duì)象，結(jié)果已經(jīng)公布⑦。在蛋白A與抗體分子的特異識(shí)別機(jī)理方面的探索也有了進(jìn)展⑧。研究發(fā)現(xiàn)，IgG分子的Fc部分存在較為穩(wěn)定的含組氨酸的結(jié)構(gòu)，而蛋白A的IgG分子識(shí)別結(jié)構(gòu)域中也存在類似的穩(wěn)定組氨酸結(jié)構(gòu)，兩者的咪唑分子能夠?qū)崿F(xiàn)面對(duì)面的排列，在中性pH條件下，兩者的咪唑分子都沒有帶電荷，咪唑環(huán)之間的疏水作用對(duì)蛋白A和IgG的非共價(jià)鍵結(jié)合起到了加強(qiáng)作用，氫鍵的形成也促進(jìn)了蛋白A與IgG分子的結(jié)合。在pH下降到酸性條件時(shí)，兩者組氨酸的咪唑環(huán)呈完全帶電荷的狀態(tài)，彼此相斥，使蛋白A和IgG的非共價(jià)鍵結(jié)合體分開⑨。也有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白A與人類IgG的不同亞型的親和力存在差別。一般說來，蛋白A對(duì)人的IgG1 和IgG4結(jié)合力強(qiáng)于IgG2，而對(duì)IgG3的結(jié)合力最差。研究發(fā)現(xiàn)，IgG的糖基化程度對(duì)其和蛋白A的結(jié)合沒有影響⑩。理論上，由于蛋白A具有4個(gè)或5個(gè)識(shí)別IgG分子的結(jié)構(gòu)域，蛋白A應(yīng)該可以同時(shí)與4個(gè)或5個(gè)IgG分子結(jié)合，但實(shí)際上，這種現(xiàn)象不可能實(shí)現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道，在溶液中，每個(gè)蛋白A只能與平均“2.0～3.3”個(gè)IgG分子結(jié)合，這說明不是每個(gè)結(jié)構(gòu)域都能夠同時(shí)與IgG分子產(chǎn)生相互作用??。當(dāng)?shù)鞍譇偶聯(lián)到色譜填料表面上時(shí)，每個(gè)蛋白A分子可能同時(shí)作用的IgG分子數(shù)目會(huì)更少。

參考文獻(xiàn)① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

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1.2 蛋白A親和色譜填料的主要種類

目前，GE Haelthcare、Merck-Millipore和Thermo3個(gè)公司的蛋白A親和色譜填料產(chǎn)品在美國治療性單抗的工業(yè)生產(chǎn)中得到了應(yīng)用。這些產(chǎn)品在基材和采用的蛋白A配基性質(zhì)上迥異，造成它們?cè)谀蛪盒阅?、?dòng)態(tài)載量和所能夠承受CIP條件上有明顯不同，由此對(duì)生產(chǎn)效率產(chǎn)生影響。

1.2.1 GE Healthcare公司的產(chǎn)品

該公司早期是瑞典Pharmacia公司，所有蛋白A親和色譜填料產(chǎn)品由瓊脂糖經(jīng)過交聯(lián)制成。早期的產(chǎn)品是rProtein A Sepharose，由多孔瓊脂糖微球制成，交聯(lián)度較低，耐壓不超過2個(gè)大氣壓，使用時(shí)必須嚴(yán)格控制操作壓力，屬于典型的可壓縮型填料。這個(gè)產(chǎn)品使用的是重組蛋白A，通過位于C端的半胱氨酸與CNBr活化的瓊脂糖多孔微球以硫醚鍵偶聯(lián)。這種偶聯(lián)方式后來被不斷改進(jìn)，蛋白A通過單個(gè)硫醚鍵與活化臂相連，保證蛋白A的N端向外的伸展，從而增加與抗體分子的接觸機(jī)會(huì)。使用CNBr活化雖然有效，但必須使用有毒化學(xué)品，操作危險(xiǎn)性較高。

與rProtein A Sepharose FF產(chǎn)品一樣，20世紀(jì)后推出的MabSelect仍然使用重組蛋白A，但活化臂改為含醚結(jié)構(gòu)的環(huán)氧化合物，重組蛋白A通過位于C端的半胱氨酸與環(huán)氧基團(tuán)活化臂以硫醚鍵偶聯(lián)。通過增加交聯(lián)度，MabSelect的耐壓稍有提高，達(dá)到3個(gè)大氣壓以上。MabSelect Xtra是MabSelect的改進(jìn)版，它的配基密度更高，所以動(dòng)態(tài)載量更高，但在耐壓性能上沒有改觀。

MabSelect SuRe是繼MabSelect Xtra以后推出的產(chǎn)品，它所采用的瓊脂糖微球和MabSelect Xtra一樣，與眾不同之處是采用了前面提到過的將4個(gè)Z結(jié)構(gòu)域組合而成的耐堿蛋白A。由于可以用0.1～0.5mol/L NaOH溶液做CIP，簡化了生產(chǎn)步驟。它是第一個(gè)此類產(chǎn)品。

1.2.2 Merck-Millipore公司的產(chǎn)品

該公司的產(chǎn)品冠以ProSep A商標(biāo)。雖然Merck-Millipore公司在不斷開發(fā)新產(chǎn)品，如近幾年推出的P VA基材的Eshmuno，但真正用于治療性單抗的還是源于BioProcessing公司的蛋白A親和色譜填料產(chǎn)品。BioProcessing曾是一個(gè)英國公司，后來被Millipore收購。這個(gè)系列產(chǎn)品的確有特獨(dú)之處。從顆粒的形狀上就可見一斑，是基于多孔玻璃（control pore glass，CPG）基材。這種材料是用特殊工藝破碎的玻璃顆粒經(jīng)過篩分得到具有一定分布范圍的玻璃顆粒，完全是不規(guī)則形狀的，而玻璃顆粒上面的孔是由化學(xué)方法處理得到的。ProSep-vA的孔徑為100nm，而ProSep-vA Ultra的孔徑為70nm。后者由于采用了較小孔徑，獲得了較高比表面積，能夠負(fù)載更多的蛋白A?。通過沒有對(duì)外公布的專有技術(shù)去除玻璃表面的非特異蛋白吸附，優(yōu)點(diǎn)是能夠在較高流速下使用，提高了單位時(shí)間內(nèi)單位柱體積填料的產(chǎn)能。但多孔玻璃在堿性條件下不穩(wěn)定，ProSepA系列產(chǎn)品不能夠使用堿性CIP。由于該填料為形狀不規(guī)則的玻璃顆粒，裝柱過程中除了加壓外，還需要使用震蕩器形成穩(wěn)定的柱床。

1.2.3 Thermo公司的產(chǎn)品

該公司的產(chǎn)品以POROS為商標(biāo)，于20世紀(jì)90年代推出，與其他POROS產(chǎn)品一樣，采用貫流色譜的理念設(shè)計(jì)了聚苯乙烯-二乙烯基苯（polystyrenedivinylbenzene，PS-DVB），其特點(diǎn)是微球中除了孔徑80nm左右的微孔外，還含有貫穿孔，減低了微球內(nèi)的孔內(nèi)傳質(zhì)障礙。此外，采用表面涂覆富含羥基的化合物去除了聚苯乙烯-二乙烯基苯的非特異蛋白吸附。

表1　Sepromax?A40 Plus性能參數(shù)

1.3 動(dòng)態(tài)載量

抗體分子的親和純化都是在一定流速下進(jìn)行的，所以用動(dòng)態(tài)載量（dynamic binding capacity，DBC）來表征一種蛋白A親和填料在某種流速或接觸時(shí)間（residence time，RT）條件下，單位體積能夠“捕獲”多少抗體分子，具有直接的實(shí)際意義。為了能夠提高親和色譜的效率，研究人員認(rèn)為最佳的情形是在較短的接觸時(shí)間條件下得到較高的動(dòng)態(tài)載量?。然而，這兩者之間有著不可兼得的矛盾，較高的動(dòng)態(tài)載量常常需要較長的接觸時(shí)間才能獲得，其中的主要問題是抗體分子在填料孔內(nèi)的傳質(zhì)障礙，這是液相色譜，特別是大規(guī)模制備色譜面臨的最大挑戰(zhàn)之一，也是科學(xué)家多年來力圖解決的難題。液相色譜流速與譜帶展寬的基礎(chǔ)van Deemter公式中的C相以及后來在此基礎(chǔ)上建立的理論對(duì)此給出了詳盡描述。

van Deemter公式：

其中，R是譜帶展寬的度量；u是流速；A和B為常量，與流速無關(guān)，在大規(guī)模制備中可以忽略；C相為與傳質(zhì)障礙相關(guān)的系數(shù)?？梢娏魉僭龈?，Cu項(xiàng)也增高，對(duì)譜帶展寬的貢獻(xiàn)增大。無錫加萊克色譜科技有限公司（以下簡稱加萊克或Galak）在這個(gè)領(lǐng)域做了新的嘗試。該公司推出的Sepromax?A40 Plus蛋白A親和色譜填料的主要參數(shù)如表1所示。該填料使用了與POROS系列類似的表面親水處理。由于大多數(shù)蛋白A分子都是偶聯(lián)到填料的孔內(nèi)，抗體分子必須擴(kuò)散到孔內(nèi)才能與蛋白A產(chǎn)生相互作用?？贵w分子的分子量高于150kDa，擴(kuò)散速率較低。Yeung等?在2012年發(fā)表了類似蛋白分子在色譜填料孔內(nèi)擴(kuò)散模擬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表面類蛋白分子在色譜填料孔內(nèi)擴(kuò)散速率較溶液中慢20倍。綜合這一研究結(jié)果和前人的工作，加萊克的研究人員使用粒徑高度均一的微球作為基材，能夠保證微球間的孔隙高度一致，由此推理，使用此類微球，在保證一定反壓時(shí)，所用微球粒徑將是最小的，即孔內(nèi)擴(kuò)散的路徑長度降至最低且是幾乎一致，孔內(nèi)擴(kuò)散是同步化的。使用粒徑分布很寬的填料，如MabSelect SuRe，孔內(nèi)抗體分子的擴(kuò)散則是非同步的（圖1）。如果這類微球的孔徑足夠大，抗體分子擴(kuò)散至微球中心的傳質(zhì)障礙將下降至最低，將實(shí)現(xiàn)在較低接觸時(shí)間獲得較高動(dòng)態(tài)載量的目標(biāo)。加萊克的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。在同樣試驗(yàn)條件下，獲得40mg/mL動(dòng)態(tài)載量，MabSelect SuRe需要2.4min的接觸時(shí)間，而采用均一微球的Sepromax A40 Plus只需要1.3min接觸時(shí)間（圖2）。

圖1　部分蛋白A親和色譜填料的顯微鏡照片

圖2　動(dòng)態(tài)載量與接觸時(shí)間的關(guān)系

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1.4 去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的能力

經(jīng)過20年的技術(shù)進(jìn)步和工藝開發(fā)，治療性抗體的工業(yè)化純化流程已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)了“模塊化”，即由親和、離子交換和疏水等方法合理搭建而成。大多數(shù)純化流程的第一步是蛋白A親和色譜法，該方法中蛋白A只捕獲抗體分子，因而具有優(yōu)異的去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（host cell proteins，HCP）和DNA的能力。使用ELISA方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品上清液和經(jīng)過蛋白A親和色譜純化以后洗脫液中HCP含量，表2給出Sepromax?A40 Plus與某品牌產(chǎn)品在HCP純化效率方面的比較數(shù)據(jù)。

測(cè)試DNA雜質(zhì)的方法也已經(jīng)非常成熟，表3給出Sepromax?A40 Plus與某品牌產(chǎn)品在DNA純化效率方面的比較數(shù)據(jù)。

殘留宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、脫落的蛋白A分子、表達(dá)過程中產(chǎn)生的抗體片段、病毒以及內(nèi)毒素等等還必須經(jīng)過蛋白A親和法以后的精制純化手段才能達(dá)到最終純度要求。

表2　Sepromax?A40 Plus去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的結(jié)果

表3　Sepromax?A40 Plus去除DNA的結(jié)果

1.5 蛋白A配基脫落

所有蛋白A親和色譜填料在與抗體分子接觸后的洗脫過程都會(huì)產(chǎn)生蛋白A配基脫落。脫落的蛋白A通常與目標(biāo)抗體同時(shí)洗脫，這也是使用蛋白A親和色譜純化抗體遇到的問題之一。脫落的分子既可以是蛋白A整體，也可以是蛋白A分子的片段，分子量在6k～40kDa?，但脫落程度不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，ProSep-vA Ultra的脫落量高于MabSelect SuRe，而且在多次重復(fù)的純化過程中，ProSep-vA Ultra的脫落量呈現(xiàn)開始高、中間低、后程再升高的情況?

。MabSelect SuRe由于使用了單個(gè)共價(jià)鍵偶聯(lián)蛋白A，表現(xiàn)出較低的脫落量，因此從穩(wěn)定性方面看，使用單個(gè)共價(jià)鍵偶聯(lián)蛋白A的方法并不比多個(gè)共價(jià)鍵偶聯(lián)蛋白A的方法差，那么后者優(yōu)于前者的說法不攻自破。多孔玻璃基材的ProSep-vA Ultra在酸性洗脫抗體時(shí)出現(xiàn)脫落量較高的情形，而多孔玻璃基材本身在酸性條件下是穩(wěn)定的，所以蛋白A脫落應(yīng)該與基材分解無關(guān)，可能與蛋白A結(jié)構(gòu)有關(guān)。蛋白A脫落的機(jī)理并不明確，仍需進(jìn)一步研究。

以上所提到的各種蛋白A親和色譜填料的簡介見表4。

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2 離子交換色譜填料

如果采用蛋白A親和色譜作為純化流程的第一步，那么接下來使用離子交換（ion exchange，IEX）色譜作為精制的第一步是較為常見的模式。離子交換色譜法的基本原理是基于色譜填料表面的離子基團(tuán)與目標(biāo)分子所攜帶的粒子之間的相互作用，利用這種相互作用的差異即可達(dá)到分離純化的目的。諸多因素可以影響離子交換色譜對(duì)抗體分子的分離效果，如選用哪一種離子交換填料（陽離子交換或陰離子交換可進(jìn)一步細(xì)分為強(qiáng)陽離子交換和弱陽離子交換、強(qiáng)陰離子交換和弱陰離子交換）、填料表面離子基團(tuán)密度和離子基團(tuán)的三維分布、基材類型、孔隙率和孔徑等。所有這些因素都必須仔細(xì)考察?～?。在治療性單抗的工業(yè)純化實(shí)踐中，雖然較為罕見，但確有直接采用離子交換色譜法取代蛋白A的成功實(shí)例?。限于篇幅，本文不做詳細(xì)介紹。

表4　部分應(yīng)用于治療性單抗純化的蛋白A親和色譜填料

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2.1 陰離子交換色譜填料

陰離子交換法（anion exchange，AEX）是最常用的單抗精制純化方法之一。由于治療性單抗的等電點(diǎn)通常較高，在pH為7～7.5的緩沖液條件下，單抗分子不會(huì)與陰離子交換色譜填料產(chǎn)生任何離子間的相互作用，通常稱為流穿模式（flow-through mode）。而雜質(zhì)，如DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素在這個(gè)pH范圍都帶有負(fù)電荷，與陰離子交換色譜填料產(chǎn)生較強(qiáng)的離子相互作用，保留在色譜柱上。如果使用pH更高的緩沖液，單抗可以帶足夠的負(fù)電荷，將保留在陰離子交換色譜柱上，稱之為結(jié)合模式（binding mode）。但是，過高的pH，有導(dǎo)致單抗分子產(chǎn)生變異的可能性，所以結(jié)合模式的使用率少于流穿模式。陰離子交換法在流穿模式下還能夠去除病毒?，但它的不足之處在于對(duì)去除單抗分子多聚體和脫落的蛋白A分子效果不佳。在流穿模式下，由于蛋白A親和色譜步驟已經(jīng)大幅度地去除了DNA和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，要求陰離子交換色譜填料對(duì)這些雜質(zhì)分子有很強(qiáng)的吸附能力，但并不需要很高的動(dòng)態(tài)載量。對(duì)于在較高pH條件下仍能保持穩(wěn)定性的單抗，可以考慮采用結(jié)合模式。被稱之為弱配分色譜法（weak-partitioning chromatography，WPC）是一種新的結(jié)合模式精制單抗的方法?。此方法先是選擇合適緩沖液pH條件使目標(biāo)單抗在陰離子交換色譜柱上產(chǎn)生結(jié)合，然后使用一定電導(dǎo)率的鹽溶液進(jìn)行等度洗脫。由于目標(biāo)單抗的等電點(diǎn)較所有雜質(zhì)分子更高，雜質(zhì)分子在陰離子交換色譜柱上的結(jié)合更強(qiáng)，也就是說，在等度洗脫時(shí)，目標(biāo)單抗分子被先洗脫，而雜質(zhì)分子在后面洗脫。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用這種方法作為精制手段，改善了陰離子交換色譜流穿模式去除單抗分子多聚體和脫落的蛋白A分子的缺陷，同時(shí)保持了流穿模式去除DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的優(yōu)勢(shì)?

。表5列出了部分陰離子交換色譜填料的有關(guān)指標(biāo)。

表5　部分應(yīng)用于治療性單抗純化的強(qiáng)陰離子交換色譜填料

2.2 陽離子交換色譜填料

陽離子交換（cation exchange，CEX）法也是最常用的單抗精制純化方法之一。如前面所述，治療性單抗的等電點(diǎn)通常較高，所以，在單抗精制流程中采用陽離子交換法都是結(jié)合模式而非流穿模式。這一特點(diǎn)要求陽離子交換色譜填料必須具備優(yōu)秀的選擇性和動(dòng)態(tài)載量，這兩項(xiàng)成為衡量這類填料的最重要指標(biāo)。在很多應(yīng)用實(shí)例中，對(duì)比陰離子交換法，陽離子交換法展示了更好的去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、脫落蛋白A和高分子量單抗分子多聚體的能力?～?。值得注意的是，在現(xiàn)有的治療性單抗生產(chǎn)中，大孔聚合物基材強(qiáng)陽離子交換色譜填料得到了大范圍成功應(yīng)用。主要原因是這些填料顯示了更好的選擇性和更高的動(dòng)態(tài)載量，有研究人員指出，正是大孔聚合物基材強(qiáng)陽離子交換色譜填料本身具有的非特異疏水性質(zhì)使得它們具有更好的選擇性?。GE Healthcare后來專門把疏水特征引入離子交換色譜填料，開發(fā)了Capto等混合型色譜填料正是為了補(bǔ)上這個(gè)短板。這兩個(gè)重要指標(biāo)還沒有理論方法可以直接預(yù)測(cè)，必須通過實(shí)驗(yàn)來測(cè)定，這是使用者必須仔細(xì)考慮的。比如如何獲得最高動(dòng)態(tài)載量。早期通常認(rèn)為較低的緩沖液電導(dǎo)率和pH應(yīng)該是最有利于單抗分子與陽離子交換色譜填料實(shí)現(xiàn)相互作用。后來的研究證明并非如此。有文獻(xiàn)稱，適當(dāng)增加溶液電導(dǎo)率和適宜的pH可以增加動(dòng)態(tài)載量。一種解釋是，在較低的電導(dǎo)率和pH條件下，先結(jié)合到填料表面和孔內(nèi)的單抗分子對(duì)后來的單抗分子都帶有負(fù)電荷而且電荷排斥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，導(dǎo)致載量下降；而在較高電導(dǎo)率的緩沖液和較高pH條件下，這種負(fù)電荷之間的排斥下降，增加了動(dòng)態(tài)載量?。加萊克推出的Sepromax S40在去除單抗多聚體方面表現(xiàn)出優(yōu)異性能（圖3）。圖4給出了該填料的DBC與POROS HS50和POROS XS50的比較?？梢钥闯觯?00cm/h或更高流速下，Sepromax S40表現(xiàn)出更高的DBC。表6列出了部分陽離子交換色譜填料的有關(guān)指標(biāo)。

圖3　Sepromax S40去除單抗片段雜質(zhì)

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圖4　Sepromax S40與POROS HS50和POROS XS50的DBC比較

表6　部分應(yīng)用于治療性單抗純化的強(qiáng)陽離子交換色譜填料

3 疏水色譜填料

疏水色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是基于填料表面由共價(jià)鍵偶聯(lián)的疏水基團(tuán)（如直鏈飽和碳烷烴基團(tuán)或芳烴基團(tuán)）與蛋白質(zhì)分子表面的疏水部分的相互作用的分離純化色譜方法。這種疏水相互作用在高離子強(qiáng)度條件下較強(qiáng)，隨著離子強(qiáng)度下降而下降，洗脫是由降低離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的。通常，含較多疏水結(jié)構(gòu)域的蛋白在高離子強(qiáng)度條件下保留在疏水填料上。由于疏水色譜與離子交換的純化機(jī)理完全不同，它們可以作為互補(bǔ)的方法使用。如離子交換色譜對(duì)DNA、蛋白A殘留和內(nèi)毒素純化效果較好，而疏水色譜對(duì)這些雜質(zhì)純化效果不佳。但疏水色譜的優(yōu)勢(shì)在于它對(duì)高分子量單抗分子聚集體有較好的純化效果，其主要原因是單抗分子聚集體通常疏水性很強(qiáng)，在高離子強(qiáng)度條件下在疏水色譜填料上的保留更強(qiáng)。疏水色譜填料的動(dòng)態(tài)載量往往遠(yuǎn)低于離子交換色譜填料，所以在單抗純化中不像離子交換法使用那樣普遍。另外，由于疏水色譜必須使用離子強(qiáng)度較高的溶液，如果離子強(qiáng)度不夠，則不能使雜質(zhì)分子在疏水填料上產(chǎn)生足夠的保留；而如果離子強(qiáng)度過高，單抗會(huì)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。所以，必須建立單抗分子在不同離子強(qiáng)度和pH條件下的渾濁度（在410nm波長條件下用分光光度計(jì)檢測(cè)單抗沉淀表征）曲線。使用者還應(yīng)該通過線性洗脫試驗(yàn)來選擇填料。在結(jié)合洗脫模式下，一般不應(yīng)選擇目標(biāo)單抗很早洗脫的填料（即疏水性很弱的填料），就是說，必須在很高的離子強(qiáng)度條件下，目標(biāo)單抗才可能有保留。相反，疏水性非常強(qiáng)的填料也不是好的選擇，使用這類填料往往導(dǎo)致回收率下降。表7列出了部分疏水色譜填料的有關(guān)指標(biāo)。

表7　部分應(yīng)用于治療性單抗純化的疏水色譜填料

4 疏水性電荷誘導(dǎo)色譜

疏水性電荷誘導(dǎo)色譜（hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC）是一種相對(duì)新的分離方法，現(xiàn)在還沒有得到大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。該方法最初由Burton和Harding提出?。其配基兼有疏水和靜電相互作用，屬于混合模式色譜范疇。HCIC利用高密度的疏水基團(tuán)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的疏水作用結(jié)合，通常具有耐鹽吸附的特性；再通過調(diào)節(jié)溶液pH，使配基荷電基團(tuán)帶有和蛋白分子電性相同的電荷，借助兩者間的靜電排斥力實(shí)現(xiàn)洗脫。目前由美國波爾（Pall）公司推出的商品化介質(zhì)MEP HyperCel?，其配基為4-巰乙基吡啶（4-mercaptoethylpyridine，MEP）。結(jié)構(gòu)中含有吡啶環(huán)、疏水長鏈和硫原子，能夠在中性pH條件下通過疏水作用和親硫作用吸附抗體；當(dāng)溶液pH降低到4.8以下，吡啶環(huán)上的氮原子被質(zhì)子化，配基帶上正電，此時(shí)蛋白質(zhì)也帶正電，兩者產(chǎn)生靜電排斥而得到解離。由此可見，HCIC對(duì)抗體分子實(shí)現(xiàn)吸附的功能來自具有特定結(jié)構(gòu)的功能配基。吡啶和咪唑等含氮雜環(huán)基團(tuán)及其衍生物，具有一定的疏水性和芳香性，適當(dāng)改變pH則表現(xiàn)出帶電性質(zhì)，符合HCIC的吸附和解吸的基本特征，因此該類化合物常用作HCIC配基。Mountford等?合成一系列吡啶基瓊脂糖介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)硫原子直接連接在吡啶環(huán)的配基分離IgG效果較好。Shi等?將4-（1氫-咪唑-1-基）苯胺固定在瓊脂糖基材上，研究表明這種介質(zhì)能耐鹽上樣，對(duì)IgG有一定的選擇性吸附，動(dòng)態(tài)載量可達(dá)59mg/mL。Liu等?以2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠苽湎盗蠬CIC介質(zhì)，考察了配基密度對(duì)IgG吸附的影響，結(jié)果表明較高配基密度有利于抗體吸附。

HCIC層析具有獨(dú)特的分離性能，已在實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？贵w分離中得到應(yīng)用。Guerrier等?采用MEP HyperCel介質(zhì)從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離IgG，無需調(diào)節(jié)料液pH和離子強(qiáng)度，分離純度可達(dá)70%～99%。Ghose等?探討了HCIC分離抗體的純度不及蛋白A親和層析。Boschetti?指出MEP HyperCel從原料液中捕獲抗體的純度要低于蛋白A親和介質(zhì)，但是產(chǎn)品中的聚集體殘留量小于蛋白A親和層析產(chǎn)品中的聚集體含量。Chen等?比較了HCIC與傳統(tǒng)HIC在單抗分離方面的效果，發(fā)現(xiàn)MEP HyperCel選擇性好，簡化分離步驟，并且提高了分離效率。程華等?利用MEP HyperCel結(jié)合鹽析從小鼠腹水中分離純化單克隆抗體，純度大于90%。莊甜甜等?采用MEP HyperCel從豬血漿中分離免疫球蛋白IgG，發(fā)現(xiàn)填料吸附量較高，具有非鹽賴性，而且在pH=4條件下可實(shí)現(xiàn)蛋白的有效洗脫，IgG純度達(dá)到77.4%。Xia等??制備了以4-巰乙基吡啶、2-巰基-1-甲基咪唑和2-巰基苯并咪唑?yàn)榕浠腍CIC擴(kuò)張床介質(zhì)，分離卵黃抗體IgY，純度約90%，收率約60%。施偉等?采用2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)榕浠腍CIC介質(zhì)，從雞血漿中分離IgY，純度達(dá)到98.9%，收率80.5%。Phottraithip等?制備了以2-巰基咪唑?yàn)楣δ芘浠腃ell-TuC-N-DVS-MI介質(zhì)，從豬血漿中分離免疫球蛋白，純度為81%～90%。童紅飛等?采用以2-巰基-1-甲基咪唑?yàn)楣δ芘浠慕橘|(zhì)分別從雞血和鵝血中分離得到相應(yīng)的免疫球蛋白，純度高于92%，收率大于8 5%。Ren等?制備了MEPSepharose介質(zhì)，用于血清中自身免疫抗體的去除，發(fā)現(xiàn)MEP介質(zhì)對(duì)類風(fēng)濕因子和抗雙鏈DNA抗體的去除率分別達(dá)到96%和80%，并且研究IgG抗體純化過程中在洗脫液中添加4種環(huán)糊精，使得IgG能夠在較為溫和的條件下洗脫，提高了抗體的穩(wěn)定性?。

總的來說，雖然HCIC分離抗體的選擇性不如蛋白A親和層析，并且分離效果受原料、抗體種類和操作條件等因素影響，但是HCIC操作簡便、介質(zhì)制備容易、配基價(jià)格低廉且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)使其在抗體分離過程中是一種良好的輔助手段，在抗體的分離純化中具有良好的應(yīng)用前景。進(jìn)一步加強(qiáng)HCIC分離機(jī)理的認(rèn)識(shí)將有助于分離工藝的優(yōu)化和新型配基的設(shè)計(jì)。目前，很多研究試圖從微觀分子尺度研究配基與抗體分子之間的識(shí)別和作用模式，揭示HCIC的分離機(jī)理（51）～（53）。這種分子模擬理論和方法的發(fā)展為從微觀水平研究配基-蛋白之間的分子相互作用提供了良好的平臺(tái)。

5 結(jié) 語

與治療性抗體生產(chǎn)相關(guān)的色譜填料工業(yè)是當(dāng)今色譜技術(shù)發(fā)展的重點(diǎn)之一。它的技術(shù)高度集中，但這對(duì)整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并不是福音。事實(shí)上，治療性抗體上游表達(dá)技術(shù)的發(fā)展速度比下游色譜純化發(fā)展速度快得多。如何改變這個(gè)現(xiàn)狀，是很多人關(guān)注的事情。

作者簡介

doi:10.3969/j.issn.1674-0319.2016.01.003