陳珺汝　夏洪波　莊雪芬　郭錦錦　唐艷麗 　姚新生　孫萬邦

(深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院兒童保健科，深圳518172)

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兒童新甲型流感疫苗遠期特異性CD8+記憶T細胞的表型特征①

陳珺汝夏洪波莊雪芬郭錦錦②唐艷麗②姚新生②孫萬邦②

(深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院兒童保健科，深圳518172)

[摘要]目的：探討兒童新甲型(H1N1)流感疫苗接種后遠期外周血疫苗特異性CD8+記憶T細胞的特征。方法：選擇31例于2009年12月～2010年1月接種甲型H1N1流感疫苗的3～6歲兒童，抽取外周靜脈血5 ml，分離淋巴細胞加入甲型H1N1流感疫苗進行培養(yǎng)，并設(shè)對照組，用流式細胞儀檢測細胞表面分子的表達，同時以CCK-8法檢測細胞增殖，計算細胞增殖指數(shù)。結(jié)果：外周血PBMC中CD8+T細胞在實驗組和對照組分別是13.41%與9.41%，P>0.05。CD8+初始T細胞在兩組的比例均高達80%上；CD8+記憶T細胞在兩組占17%～19%；記憶T細胞分中央型和效應型記憶T細胞，兩個亞群檢測結(jié)果：CCR7和CD62L單陽性記憶T細胞亞群在實驗組占比明顯低于對照組的占比，P<0.05。應用CCK-8法檢測疫苗刺激后抗原特異性增殖，檢測結(jié)果見細胞增殖指數(shù)大于0.8的僅為51.16%，大于1.0在本研究中沒有。結(jié)論：31例兒童外周血PBMC中CD8+T細胞占比少，初始T細胞CD45R+均較高，具有抗原再刺激后再應答的基礎(chǔ)；甲型H1N1流感疫苗可以誘導抗原特異性記憶CD8+T細胞的產(chǎn)生，但數(shù)量不多，其中大多數(shù)為中央型記憶CD8+T細胞；細胞增殖指數(shù)結(jié)果表明疫苗特異性細胞增殖不佳；提示對該疫苗的遠期疫苗特異性CD8+T細胞免疫記憶不理想。

[關(guān)鍵詞]兒童;新甲型(H1N1)流感疫苗;記憶T細胞;遠期免疫;免疫記憶

甲型H1N1流感，是一種急性呼吸道傳染病，其病原體是一種變異的新型甲型H1N1流感病毒，2009年自墨西哥甲型H1N1流感爆發(fā)以來，全球范圍內(nèi)確診病例增長迅速，預防甲型H1N1流感最經(jīng)濟最有效的辦法就是接種疫苗，當年我國首先研制H1N1疫苗控制大流行的有效措施進行免疫接種，其疫苗應用強度大、范圍廣，有關(guān)此疫苗的免疫原性和免疫持久性僅有抗體檢測的少量報道，遠期的免疫效果與特異性初始及記憶CD8+T細胞國內(nèi)外缺少報道，本文就其疫苗特異性CD8+記憶T細胞進行研究，以期為H1N1疫苗遠期免疫效果、新疫苗制備和接種策略提供綜合評價與指導。

1材料與方法

1.1主要試劑CD8+T細胞FCM試劑：Amti-HU-CD4FITC、Amti-HU-CD8FITC、Amti-HU-CD62L PE、Amti-HU-CD45RO APC、Amti-HU-CD45RA APC-H7、Amti-HU-CD4 NHP PERCP 、Amti-HU-CD8 NHP PERCP及Amti-HU-(CD197)lCCR7 PE-CY7等試劑盒均購自美國Becton Dickinson公司，甲型H1N1流感疫苗(國藥準字S20053091) 購自大連雅立峰生物制藥有限公司，改良型RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清購自ThermoFisher生物化學制品(北京)有限公司，CO2培養(yǎng)箱，美國SHEL公司；八色FACS Calibu r流式細胞檢測儀，美國Becton Dickinson 公司，細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學研究所。

1.2對象按自愿原則選擇2009年12月～2010年1月在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院接種新甲型H1N1流感疫苗的3～6歲兒童為研究對象31例，接種疫苗均3～4年。

1.3標本無菌采31例接種新甲型流感疫苗的兒童靜脈血3 ml于抗凝管中，輕輕搖動試管，混勻，5 min后加入等量D′Hank′s液，手動輕輕搖勻。分離淋巴細胞 取淋巴細胞分離液2 ml于滅菌離心管內(nèi)。離心、洗滌淋巴細胞，加RPMI1640培養(yǎng)液2 ml離心后棄上清，留沉淀細胞，調(diào)整淋巴細胞濃度(細胞數(shù)1×106ml-1)。

1.4淋巴細胞體外培養(yǎng)分組 將PBMCs 1×106ml-1培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，實驗組加入新甲型H1N1流感疫苗(濃度3.0 μg/ml)，每組設(shè)3個復孔；對照組細胞不加新甲型H1N1流感疫苗，每孔加10%FCS-RPMI1640培養(yǎng)液100 μl，置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)50 h。

1.5檢測細胞表面分子取100 μl培養(yǎng)細胞于試管中，分別加入抗人CD4-FITC、CD8-FITC 等6種單克隆熒光抗體各10 μl。加入溶血素2 ml溶解紅細胞，處理后加入固定液300 μl重懸細胞，BD-FACBCalibur流式細胞分析儀檢測細胞表面分子：CD4/CD8、CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7。

1.6細胞增殖實驗實驗組與對照組置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)50 h后，分別每標本取100 μl加入96孔培養(yǎng)板，細胞數(shù)為1×105ml-1；向每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。比色(測定)：用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔吸光度(A值，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=620 nm)計算細胞增殖指數(shù)，了解記憶細胞疫苗特異性增殖反應。

1.7分組本研究根據(jù)同組實驗檢測31例兒童外周血新甲型H1N1流感抗體的高低水平，將31例研究對象分高應答組(12例)、應答組(12例)和低應答組(7例)。

1.8統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 版軟件，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以χ2表示，差異顯著性采用方差分析檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1H1N1疫苗接種兒童CD8+T細胞檢測結(jié)果 特異疫苗刺激的實驗組與對照組外周血PBMC中CD8+T細胞分別為13.41%與9.41%，兩組比較經(jīng)統(tǒng)計學處理無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

圖1　流感疫苗接種兒童CD8+T細胞檢測結(jié)果Fig.1　Detection results of CD8+T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

圖2　流感疫苗接種兒童CD8+CD45RA+初始T細胞檢測結(jié)果Fig.2　Detection results of CD8+CD45RA+naive T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

圖3　流感疫苗接種兒童CD8+CD45RO+記憶T細胞檢測結(jié)果Fig.3　Detection results of CD8+CD45RO+ memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

圖4　流感疫苗接種兒童CD8+CD45RO+記憶T細胞亞群檢測結(jié)果Fig.4　Detection results of single positive CD8+memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for childrenNote: ▲.P<0.05，vs CCR7 of experimental group，#.P<0.05，vs CD62L of experimental group.

2.2H1N1疫苗接種兒童CD8+CD45RA+初始T細胞檢測結(jié)果根據(jù)CD45RA/CD45RO的表達與否，CD8+CD45RA+CD45RO-細胞為CD8+初始T細胞；CD8+初始T細胞檢查結(jié)果(見圖2)，CD8+初始T細胞在實驗組與對照組均高達80%以上，P>0.05。同時按ELISA法抗體水平≥200 μg/L為高應答組，≤100 μg/L為低應答組，介于二者間為中應答組，高中低三組比較，三組間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。

2.3H1N1疫苗接種兒童CD8+CD45RO+記憶T細胞檢測結(jié)果根據(jù)CD45RO的表達與否，可將CD8+T細胞分為CD8+CD45RO+和CD8+CD45RO-兩個細胞亞群，CD8+CD45RO+細胞為CD8+記憶T細胞；CD8+記憶T細胞檢測結(jié)果(見圖3)：CD8+記憶T細胞在實驗組與對照組均為17%～19%，二組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05；同時按抗體水平高低分三組比較，三組間差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。

2.4H1N1疫苗接種兒童CCR7和CD62L記憶T細胞亞群檢測結(jié)果記憶T細胞(CD45RO+)再根據(jù)歸巢受體(CD62L)和趨化因子受體(CCR7)表達與否，將CD8+記憶T細胞進一步分為即CD62L+、CCR7+細胞二個不同的細胞亞群；CD8+CD45RO+記憶T細胞二個亞群檢測結(jié)果(見圖4)：實驗組與對照組CCR7單陽性記憶T細胞亞群分別是41.42%和43.31%；二組比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。CD62L在實驗組與對照組分別是17.00%和60.55%，二組比較實驗組明顯低于對照組，P<0.05。

圖5　流感H1N1疫苗接種兒童疫苗特異性細胞增殖指數(shù)檢測結(jié)果Fig.5　Detection results of cellular proliferation index after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

2.5H1N1疫苗接種兒童疫苗特異性細胞增殖指數(shù)檢測結(jié)果細胞免疫功能狀態(tài)的檢測常常以細胞增殖實驗的結(jié)果進行考核，本研究在應用CCK-8法檢測疫苗刺激后抗原特異性增殖，檢測結(jié)果(見圖5)可見細胞增殖指數(shù)大于0.8的僅為51.16%，大于1.0在本研究中沒有。

3討論

流行性感冒簡稱流感，是一種急性呼吸道傳染病，致病原為流行性感冒病毒，人群普遍易感。其中，甲型流感病毒對人類的威脅最大，最容易形成大流行[1]。2009年暴發(fā)嚴重的 “甲型H1N1流感” 疫情[2]，為有效應對甲型H1N1流感疫情，我國新甲型H1N1流感疫苗從研制到臨床應用僅3個月完成，全國開展了有關(guān)人群免疫接種，對于當時社會穩(wěn)定和提高人群特異性免疫力做出了重要貢獻。從2009年應用至今，缺乏遠期免疫持久性的研究報告。免疫記憶是疫苗學的基礎(chǔ)，長期來對遠期免疫效果及免疫記憶以產(chǎn)生抗體及抗體的滴度進行評價[3]，Sallusto等[4-7]研究表明體內(nèi)確實存在記憶B細胞和記憶T細胞，而對細胞內(nèi)感染的微生物抗感染，T細胞介導的免疫應答更為重要[8]，從而對記憶性T細胞有了新的認識[9]。在正常人周圍血中，T淋巴細胞是多種表型的細胞亞群組成。根據(jù)功能與MHC分子的限制性不同，T細胞可分為CD4+和CD8+T細胞[10-14]。CD8+T細胞的TCR識別的抗原肽被MHCⅠ類分子呈遞。CD8+T細胞主要介導細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的細胞毒活性表現(xiàn)為直接對靶細胞的殺傷或通過細胞因子介導細胞毒。本研究對流感H1N1疫苗接種31例兒童外周血細胞進行分離培養(yǎng)，以流式細胞儀檢測CD8+T細胞，結(jié)果PBMC中CD8+T細胞在疫苗刺激實驗組與對照組沒有差異(P<0.05)，這一結(jié)果也與正常人外周血CD8+T細胞分布規(guī)律一致。CD8+T細胞實驗組比對照組略有升高，經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異P>0.05。這種結(jié)果提示實驗組較對照組高，雖然CD8+T細胞數(shù)量少，但在疫苗刺激下均有特異性增殖。

成熟的T細胞是高度不均一的細胞群體，根據(jù)T細胞是否曾受到抗原的刺激分為初始T細胞、效應T細胞(Effector T cell,Te)和記憶T細胞[15]。目前普遍根據(jù)CD45RA的表達與否分初始T細胞(CD45RA+)和記憶T細胞(CD45RO+)兩大亞群。初始T細胞是沒有接受過抗原刺激的成熟T細胞，在沒有接觸特異性抗原分子刺激前相對靜止的狀態(tài)。初始T細胞能識別、結(jié)合不同的特異性抗原。在感染或用疫苗時，特異性抗原進入機體，選擇性激活某些表達特異性TCR的初始T細胞克隆，并迅速增殖，分化成效應性T細胞，發(fā)揮特定的細胞免疫功能[16]。CD8+初始T細胞檢測結(jié)果在實驗組與對照組均高達80%以上(P>0.05)；同時按照傳統(tǒng)考核疫苗效果以抗體水平高低分三組進行比較，三組間比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。提示這批31例兒童初始T細胞在比例良好，表明具有抗原再刺激后再應答的基礎(chǔ)。CD8+記憶T細胞表達CD8+CD45RO+，再一次受到抗原刺激后，記憶T細胞能夠迅速增殖，發(fā)揮效應功能，包括輔助功能、殺傷功能和調(diào)節(jié)功能[17,18]。流感病毒是細胞內(nèi)感染，因此對流感疫苗誘導機體的免疫力，研究記憶細胞具有十分重要的意義。CD8+記憶T細胞檢測結(jié)果在兩組為17%～19%(P>0.05)；同時按照傳統(tǒng)考核疫苗效果以抗體水平高低分三組進行比較，三組間比較差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05?？乖罨磻杆賾撌荂D8+記憶T細胞，本實驗CD8+CD45RO+記憶T細胞在實驗組占19.5%，對照組占17.5%，提示甲流H1N1疫苗接種3年多后特異性免疫記憶T細胞在數(shù)量上是不多的，其功能無特異性再次應答。

近年研究表明，記憶T細胞具有高度多樣性，根據(jù)歸巢受體(CD62L)和趨化因子受體(CCR7)的表達情況，可將記憶性T細胞分中央型和效應型記憶T細胞。效應型記憶T細胞(CCR7-/CD62L-)主要存在于血液、脾臟和非淋巴組織，當受到抗原的刺激后能迅速分化成效應細胞，產(chǎn)生效應分子。中央型記憶T細胞(CCR7+/CD62L+)存在于淋巴結(jié)、脾臟和血液不存在于非淋巴組織，當受到抗原的刺激后其分化成效應細胞及產(chǎn)生效應分子或?qū)Π屑毎臍?，其作用較慢。本研究CCR7和CD62L檢測結(jié)果表明，記憶T細胞亞群表型特征大多數(shù)為中央型記憶細胞；在實驗組中CCR7和CD62L單陽性記憶T細胞兩者均低的同時CD62L+細胞百分比低的幅度大。這種表型特征與吳長有研究的正常人外周血記憶細胞及人外周血BCG特異性記憶T細胞研究的報道結(jié)果一致[19-21]。

在抵抗病毒感染的過程中，細胞免疫應答發(fā)揮重要作用。CD4+和CD8+T細胞是細胞免疫應答的重要組成部分。細胞增殖實驗是考核免疫細胞受抗原刺激后發(fā)生應答的能力，本研究在應用CCK-8法檢測疫苗刺激后抗原特異性增殖，可見細胞增殖指數(shù)大于0.8的為51.16%，大于1.0在本研究中沒有，結(jié)果表明流感H1N1疫苗接種兒童疫苗特異性細胞增殖不理想。疫苗特異刺激細胞表型特征綜合分析，H1N1流感疫苗遠期特異性免疫記憶T細胞亞群表型特征大多數(shù)為中央型記憶細胞，這種表型特征對抗原刺激產(chǎn)生應答效應緩慢。目前H1N1流感疫情不容樂觀，廣東省2013年公布傳染病數(shù)據(jù)，報告1 535例甲型H1N1流感病例，發(fā)病數(shù)是2012年的170倍左右。根據(jù)本研究結(jié)果提示，為有效預防H1N1流感建議在高危人群或流感流行季節(jié)每6個月進行一次免疫接種；從免疫記憶結(jié)果出發(fā)應該研究新型的感疫苗。由于本次研究樣本量不多，流感疫苗T細胞免疫記憶也無相關(guān)研究借鑒，因此，流感疫苗免疫記憶值得我們深入研究。

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[收稿2015-06-24二次修回2016-01-08]

(編輯許四平)

Characterization of naive and memory T cell after immunization with H1N1 influenza vaccine for children

CHENJun-Ru，XIAHong-Bo,ZHUANGXue-Fen,GUOJin-Jin,TANGYan-Li,YAOXin-Sheng,SUNWan-Bang.

ShenzhenLonggangMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen518000,China

[Abstract]Objective:To elucidate the characterization of CD8+T cell in H1N1 influenza vaccine for children.Methods: PBMCs were isolated from 31 children aged from 3 to 6 years old who had accepted H1N1 influenza vaccine during December 2009 to January 2010.The lymphocytes were joined with the H1N1 influenza vaccine as experimental group and cultured.The experiment set without vaccine group as control group.At last we detected the surface molecules by FCM.The CCK-8 assay was added to detecting cellular proliferation and cellular proliferation index were detected by CCK-8.Results: CD8+T cells of PBMC in the two groups were 13.41% and 9.41%,P> 0.05.CD8+CD45RAA+naive T cells in the two groups were up to more than 80%,P> 0.05.The proportion of CD8+CD45ROA+memory T cells in two groups were up to 17%-19%,P> 0.05.Two subsets of CD8+CD45ROA+memory T cells :CCR7+and CD62L+single positive memory T cell subsets in the experimental group were significantly lower than that of the control group,P<0.05.The CCK-8 assay was added to detect cellular proliferation.Only 51.16% of which cellular proliferation index was greater than 0.8,with none was greater than 1 in this study.Conclusion: This study showed that the CD4+T cells were low-level,naive T cells (CD8+CD45RAA+)were higher,with antigen stimulation and response.H1N1 vaccination specific memory T cells were few in number,specific memory T cell subsets were diversity,control memory cells were the main phenotypic characteristics.Cellular proliferation index showed that the proliferation of specific CD8+T cells vaccine was poor.

[Key words]Children；H1N1 vaccine；Immune vaccine；Memory T cell； Immunization long-term；Immune memory

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0396-05

作者簡介：陳珺汝(1980年-)，女，碩士，主要從事兒童預防保健研究，E-mail:13590221386 @163.com。通訊作者及指導教師：孫萬邦(1950年-)，男，教授，碩士生導師，主要從事分子與臨床免疫學研究，E-mail:sunwb7224@sina.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.022

①本文為深圳市龍崗區(qū)科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生項目(201406093001035)和國家自然科學基金項目(81441048)。

②共同第一作者，遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)免疫學教研室，珠海519041。