李寶輝　樊竑冶　劉　飛　任德善　侯亞義　周長林

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009)

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·臨床免疫學(xué)·

早期細(xì)胞凋亡引起活動期狼瘡小鼠的B細(xì)胞比例下降①

李寶輝樊竑冶劉飛②任德善②侯亞義②周長林

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009)

[摘要]目的：探索活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細(xì)胞數(shù)量的變化及其調(diào)節(jié)機制。方法：利用流式細(xì)胞儀，首先分析了18周齡活動期MRL/lpr狼瘡小鼠與正常C57/B6小鼠脾臟中B細(xì)胞的周期和B細(xì)胞占脾臟淋巴細(xì)胞的百分比；用Annexin V和PI標(biāo)記方法檢測了B細(xì)胞及其亞類凋亡情況；進(jìn)一步磁珠分選純化小鼠脾臟B細(xì)胞，實時定量 PCR方法檢測相關(guān)凋亡基因的表達(dá)變化。結(jié)果：與C57/B6小鼠相比，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01)，而凋亡比例顯著增加(P<0.01)，其中B細(xì)胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，而晚期凋亡未改變；凋亡的B細(xì)胞包括未成熟和成熟B細(xì)胞。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞中抗凋亡蛋白BIRC3明顯降低(P<0.01)，而促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加(P<0.01)。結(jié)論：活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞的數(shù)目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，提示活動期SLE患者B細(xì)胞的減少可能與其早期凋亡相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]B細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；MRL/lpr狼瘡小鼠

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及全身多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病，它以自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞活化導(dǎo)致大量自身抗體的產(chǎn)生以及組織損傷為特征[1]。普遍認(rèn)為，B細(xì)胞在SLE發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。許多研究證實，SLE患者B細(xì)胞發(fā)生異常，且其活動期B細(xì)胞數(shù)量明顯減少[3,4]?？墒且恍┭芯繄蟮溃琒LE患者中凋亡的細(xì)胞主要是T細(xì)胞[5]；活動期SLE患者的T細(xì)胞凋亡頻率明顯高于非活動期患者，且與病程密切相關(guān)，而B細(xì)胞凋亡不受疾病活動的影響[6]?？梢姡钳徎顒悠贐細(xì)胞數(shù)量明顯減少是否與其凋亡相關(guān)仍有待闡明。

MRL/lpr小鼠是常用的狼瘡動物模型之一。MRL/lpr小鼠的癥狀與人類SLE相似。一般認(rèn)為，MRL/lpr小鼠中含有與細(xì)胞凋亡有關(guān)的 Fas 基因隱性突變，導(dǎo)致 T細(xì)胞的死亡率降低和自身免疫反應(yīng)加速[7,8]；MRL/lpr小鼠中Fas 基因突變不參與BCR誘導(dǎo)的成熟B細(xì)胞凋亡[9,10]。也研究發(fā)現(xiàn)Fas參與B細(xì)胞不同發(fā)育階段的正常凋亡過程[11]；MRL/lpr狼瘡小鼠中IFN-α上調(diào)死亡域相關(guān)蛋白6導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞減少[12]。另外，有研究報道，活化誘導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡在NZB/W F1狼瘡小鼠和 BALB/c小鼠之間是相似的，提示異常的細(xì)胞因子表達(dá)可能在NZB/W F1狼瘡小鼠的活化B細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用[13]?？墒?，至今對于活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細(xì)胞數(shù)量的變化及其調(diào)節(jié)機制不詳。因此，本研究探索活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細(xì)胞數(shù)量的變化及其調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn)活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞的數(shù)目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，提示活動期SLE患者B細(xì)胞的減少可能與其早期凋亡相關(guān)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級正常C57/B6小鼠以及MRL/lpr狼瘡小鼠各10只，購自南京大學(xué)模式動物研究所。在南京大學(xué)醫(yī)院實驗動物SPF級動物室飼養(yǎng)后用于實驗。

1.1.2試劑與儀器FITC-anti-CD19、PE/Cy5-anti-CD138、PE-anti-IgM、APC-anti-IgD以及 isotype control 均購自eBioscience 公司；小鼠CD19+陽選磁珠購自Miltenyi公司； RPMI1640與胎牛血清培養(yǎng)基購自Gibco公司；qRT-PCR引物合成于Invitrogen公司；FACS calibur流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品;實時定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1無菌脾臟單個細(xì)胞懸液的制備脫頸椎處死小鼠，放入75%的酒精滅菌10 min；在超凈工作臺內(nèi)取小鼠脾臟于無菌PBS中，用鑷子拉碎，200目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去組織和團(tuán)塊；1 200 r/min離心5 min；加入預(yù)冷至4℃的紅細(xì)胞裂解液(ACK)，充分混勻振蕩，4℃靜置5 min；4℃ 1 200 r/min離心5 min，去上清；適量無菌PBS重懸。

1.2.2細(xì)胞周期和凋亡檢測收取懸浮的B細(xì)胞，70%乙醇4°C固定過夜。PBS洗去乙醇后，加入100 μl 含10 μg/ml PI(碘化丙啶)(Sigma公司)、0.2% Triton-100和2% RNase (Sigma)的染液，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后重懸于流式管，流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測DNA含量，每樣收取至少20 000個細(xì)胞。ModFit軟件分析結(jié)果。細(xì)胞凋亡實驗用binding緩沖液重懸細(xì)胞于流式管，先后加入0.5 μl Annexin V-FITC試劑(BD公司)和2 μl 10 μg/ml PI染液，避光孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3B細(xì)胞的分離純化700 μl磁珠專用PBS重懸107個脾臟單個細(xì)胞，加入100 μl CD19+單抗偶聯(lián)的磁珠，混勻，4℃孵育15 min；5 ml磁珠專用PBS洗一次，4℃，1 200 r/min離心10 min，去上清；將上述磁珠和細(xì)胞的混合液對倍稀釋后，使用磁珠分離柱(LS)對細(xì)胞進(jìn)行陽選，得到磁珠標(biāo)記陽性的細(xì)胞群，即純化的小鼠脾臟B細(xì)胞。適量PBS重懸，PE標(biāo)記的抗小鼠CD19單克隆抗體標(biāo)記純化后的B細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測B細(xì)胞純度。

1.2.4實時定量熒光PCR儀檢測B細(xì)胞中基因的表達(dá)收集B細(xì)胞，總RNA抽提按Trizol試劑(Invitrogen公司)說明書進(jìn)行，提取的總RNA用紫外分光光度儀(Bio-Rad，USA)測A260。以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行實時定量PCR，反應(yīng)條件參照 FastStart Universal SYBR Green Master Real Time PCR Quantitation Kit提供的說明書操作。BIRC3、BCL2L1以及BBC3(PUMA)的相對表達(dá)水平用2-△Ct計算。

2結(jié)果

2.1活動期狼瘡機體中的B細(xì)胞周期中S期增加MRL/lpr小鼠是常用的狼瘡動物模型之一，在15至20周齡時出現(xiàn)顯著的血清自身抗體、免疫復(fù)合物腎小球腎炎、血管炎等表現(xiàn)。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)及DNA合成后期(G2期)。我們利用流式細(xì)胞儀，首先分析了18周齡MRL/lpr小鼠的B細(xì)胞周期，結(jié)果表明，與同周齡的C57/B6小鼠相比，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠B細(xì)胞的G1期和G2期沒有發(fā)生有意義的變化，但其S期B細(xì)胞的比例明顯增加(P<0.05)，見圖1。

2.2活動期狼瘡機體中的B細(xì)胞比例下降雖然許多研究證實，SLE患者和狼瘡易感小鼠的B細(xì)胞均發(fā)生異常，且SLE活動期B細(xì)胞數(shù)量明顯減少，但關(guān)于活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中B細(xì)胞數(shù)量的變化存在爭議。CD19是B細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志。為此，我們采用CD19抗體標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀比較了活動期MRL/lpr狼瘡小鼠與正常C57/B6小鼠脾臟中CD19陽性 B細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細(xì)胞比例明顯低于正常的C57/B6小鼠(P<0.01)，見圖2。

2.3活動期狼瘡機體中的B細(xì)胞早期凋亡比例增加，而晚期凋亡未改變?yōu)榱舜_定活動期MRL/lpr狼瘡小鼠B細(xì)胞比例減少是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，我們用Annexin V和PI標(biāo)記B細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果表明，活動期狼瘡機體中總的淋巴細(xì)胞凋亡比例明顯增加(P<0.05)，其中B細(xì)胞的凋亡顯著增加(P<0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，活動期狼瘡機體中B細(xì)胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，而晚期凋亡未改變(圖3)。

圖1　活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞周期的S期增加Fig.1　S phase of cell cycle was increased in active lupus B cellNote: A-E.The G1，S and G2 phase of cell cycle were detected in the splenic B cells from normal and MRL/lpr mice by using flow cytometry.*.P<0.05.

圖2　活動期狼瘡小鼠機體中的B細(xì)胞比例下降Fig.2　Percent of spleenic B cell was decreased in active MRL/lpr miceNote: A-B.The percent of CD19+B cells in spleenic lymphocyte was detected in normal and MRL/lpr mice by flow cytometry.*.P<0.01.

2.4小鼠脾臟B細(xì)胞各亞群分析B細(xì)胞的分類相當(dāng)復(fù)雜，CD138一般被認(rèn)為是漿細(xì)胞的標(biāo)志，IgD 是成熟B細(xì)胞的標(biāo)志，IgM是未成熟B細(xì)胞的標(biāo)志。我們的結(jié)果表明，與正常小鼠相比，活動期狼瘡機體中漿細(xì)胞凋亡的比例沒有變化，而未成熟和成熟B細(xì)胞的凋亡明顯增加(P<0.01)，見圖4。

2.5MRL/lpr 小鼠B細(xì)胞抗凋亡基因表達(dá)降低，而促凋亡基因表達(dá)增加凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同。至今對細(xì)胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識還是不全面的。我們僅僅檢測了一些細(xì)胞凋亡的基因，結(jié)果表明，與正常小鼠相比，活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑家族成員BIRC3明顯降低(P<0.01)，而Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加(P<0.01)，見圖5。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化無差異的數(shù)據(jù)沒有提供。

圖3　活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞早期凋亡比例增加，而晚期凋亡未改變Fig.3　Percent of early apoptotic B cells were increased in active MRL/lpr mice,while not late apoptotic B cellsNote: A.The percent of apoptotic cells in mouse spleenic lymphocyte；B.The percent of apoptotic B cell in mouse spleen；C-E.The percent of early and late apoptotic B cells in mouse spleen.*.P<0.01.

圖4　小鼠脾臟B細(xì)胞各亞群凋亡分析Fig.4　Apoptotic cells in each B cell subpopulation of mouse spleenNote: A.The apoptotic percent of CD138+B cells,IgM+B cells,and IgD+B cells in mouse spleen；B.Flow cytometry analysis of the apoptotic B cell subpopulation.*.P<0.001.

圖5　Q-PCR法檢測正常和MRL/lpr小鼠脾臟B細(xì)胞中BIRC3、BCL2L1和BBC3的表達(dá)差異Fig.5　Gene expression differences of BIRC3,BCL2L1 and BBC3 were detected in B cells from normal and MRL/lpr mouse spleen by Q-PCRNote: Expression of anti-apoptotic gene was decreased in MRL/lpr mice,while pro-apoptotic gene was increased.*.P<0.01，**.P<0.001.

3討論

許多研究證實，SLE患者B細(xì)胞發(fā)生異常，且狼瘡活動期B細(xì)胞數(shù)量明顯減少[3,4]，但一些研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中凋亡的細(xì)胞主要是T細(xì)胞[5]；活動期SLE患者的T細(xì)胞凋亡頻率與病程密切相關(guān)，而B細(xì)胞凋亡不受疾病活動的影響[6]?？梢?，狼瘡活動期B細(xì)胞數(shù)量明顯減少是否與其凋亡相關(guān)仍有待闡明。MRL/lpr狼瘡小鼠的癥狀與人類SLE相似。一般認(rèn)為，MRL/lpr小鼠中含有與細(xì)胞凋亡有關(guān)的 Fas 基因隱性突變，導(dǎo)致 T細(xì)胞的死亡率降低和自身免疫反應(yīng)加速[7,8]；MRL/lpr小鼠中Fas 基因突變不參與BCR誘導(dǎo)的成熟B細(xì)胞凋亡[9,10]。也有研究發(fā)現(xiàn)Fas參與B細(xì)胞不同發(fā)育階段的正常凋亡[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細(xì)胞比例明顯低于正常的C57/B6小鼠(P<0.01)(圖2)；活動期狼瘡小鼠機體中總的淋巴細(xì)胞凋亡比例明顯增加(P<0.05)，其中B細(xì)胞的凋亡顯著增加(P<0.01)。我們分析發(fā)現(xiàn)，活動期狼瘡小鼠機體中B細(xì)胞的早期凋亡比例增加(P<0.01)，且未成熟和成熟B細(xì)胞的凋亡明顯增加(圖4)。已有研究報道，在NZB/W F1狼瘡小鼠和 BALB/c小鼠之間，活化誘導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡是相似的[13]；MRL/lpr狼瘡小鼠中IFN-α能夠上調(diào)死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白6 導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞減少[12]。事實上，活動期MRL/lpr狼瘡小鼠中許多細(xì)胞參與狼瘡的發(fā)生和發(fā)展[14]，提示異常的細(xì)胞因子表達(dá)可能在MRL/lpr狼瘡小鼠的活化B細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

細(xì)胞凋亡可幫助調(diào)節(jié)B細(xì)胞的發(fā)育。Fas是一種細(xì)胞表面受體，其活化可引發(fā)一系列事件最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 在MRL-lpr/lpr小鼠中 Fas 是有缺陷的，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力可能降低[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雖然抗原和抗原抗體復(fù)合物能誘導(dǎo)生發(fā)中心B細(xì)胞大量凋亡，但這種抗原和抗原抗體復(fù)合物誘導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡與補體無關(guān)[16]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑家族成員BIRC3明顯降低，而Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加。一般認(rèn)為，外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號途徑參與自身免疫的發(fā)生。內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑由Bcl-2 家族蛋白介導(dǎo)。Bcl-2 家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[如BCL2L1和BBC3(PUMA)][17]。 BCL2L1和BBC3(PUMA)在許多刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[18]。BBC3(PUMA)是依賴T細(xì)胞的B細(xì)胞免疫應(yīng)答中主要調(diào)節(jié)劑，調(diào)控記憶性B細(xì)胞的生存[19]。BIRC3屬于細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)家族，能調(diào)節(jié) caspase 活性、細(xì)胞分裂及細(xì)胞生存[20]。 因此，我們結(jié)果提示，活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞的數(shù)目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，即抑制凋亡BIRC3的降低及促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)的增加。

綜上所述，本研究結(jié)果表明活動期MRL/lpr狼瘡小鼠的B細(xì)胞比例明顯減少，而凋亡比例顯著增加；抗凋亡蛋白BIRC3明顯降低，而促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明顯增加。這些結(jié)果提示，活動期狼瘡小鼠B細(xì)胞的數(shù)目減少及早期凋亡的增加可能歸功于抗凋亡與促凋亡蛋白的平衡改變，活動期SLE患者B細(xì)胞的減少可能與其早期凋亡相關(guān)。

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[收稿2015-07-01修回2015-08-13]

(編輯張曉舟)

Early apoptosis leads to decrease of B cells in MRL/lpr mice

LIBao-Hui,FANHong-Ye,LIUFei,RENDe-Shan,HOUYa-Yi，ZHOUChang-Lin.

StateKeyLaboratoryofNaturalMedicines,SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China

[Abstract]Objective:To explore the change of B cell numbers in active MRL/lpr lupus mice,and their regulation mechanisms.Methods: B cell cycle and the percent of B cells in spleen lymphocytes of active MRL/lpr lupus mice and normal C57/B6 mice were analyzed by using flow cytometry.The apoptotic B cells and their subclass were analyzed by Annexin V and PI staining.Further more,B cells were purified by magnetic sorting,and real-time quantitative PCR was carried out to detect apoptosis-related gene.Results: Compared with the C57/B6 mice,the percent of B cells in active MRL/lpr lupus mice were significantly reduced(P<0.01),while the percent of apoptotic cells were significantly increased(P<0.01).The percent of early apoptotic B cells were significantly increased(P<0.01)which including the immature and mature B cells,while the late apoptotic B cells were unchanged.Further more,we found that the anti-apoptotic protein BIRC3 was significantly reduced in active lupus B cells(P<0.01),while the pro-apoptotic protein BCL2L1 and BBC3(PUMA) were significantly increased(P<0.01).Conclusion: B cells in active lupus mice were significantly reduced while early apoptotic B cells were increased,which may be attributed to the changed balance between the anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins,suggesting the reduction of B cells in SLE patients may be related to their increased early apoptosis.

[Key words]B cell；Cell apoptosis；MRL/lpr lupus mouse

中圖分類號R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0385-05

作者簡介：李寶輝(1989年-)，男，碩士，主要從事細(xì)胞與分子免疫研究，E-mail：cpulbh@126.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：樊竑冶(1984年-)，女，博士，講師，主要從事細(xì)胞與分子免疫研究，E-mail：changqingshu2004@126.com。周長林(1964年-)，男，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事抗生素藥效學(xué)研究，E-mail：cl-zhou@cpu.edu.cn。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.020

①本文為國家自然科學(xué)青年基金(8150060624)、江蘇省自然科學(xué)青年基金(SBK2015041401)、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金培育項目(2015PY007)。

②南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院和生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點實驗室，南京210093。