蔣　蓉　李軍強(qiáng)　楊鳴鳴　朱　濤　宇學(xué)鋒　邵忠琦

(天津康希諾生物技術(shù)有限公司，天津市呼吸道細(xì)菌重組及結(jié)合疫苗企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

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人乳頭瘤病毒L2蛋白的病毒樣顆粒疫苗研究

蔣蓉李軍強(qiáng)楊鳴鳴朱濤宇學(xué)鋒邵忠琦

(天津康希諾生物技術(shù)有限公司，天津市呼吸道細(xì)菌重組及結(jié)合疫苗企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

[摘要]目的：構(gòu)建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)與人乳頭瘤病毒(HPV)L2抗原的融合蛋白，在大腸桿菌中重組表達(dá)形成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)；通過小鼠模型檢測(cè)HBc-L2融合蛋白的免疫原性，并研究免疫后獲得的小鼠血清對(duì)HPV假病毒的中和效力。方法：通過DNA合成構(gòu)建16型人乳頭瘤病毒L2基因片段與HBcAg基因的融合基因，將其克隆至表達(dá)載體pET9a并在大腸桿菌中進(jìn)行HBc-L2融合蛋白表達(dá)；將經(jīng)純化、鑒定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)L2抗原的抗體效價(jià)，并分別研究小鼠血清對(duì)16型和18型HPV假病毒的中和效力。結(jié)果：HBc-L2融合基因經(jīng)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)形成可溶性蛋白，經(jīng)硫酸銨沉淀和CL-4B凝膠分離純化后獲得純度>80%的HBc-L2蛋白；分子篩高效液相色譜-多角度激光光散射(SEC-MALS)聯(lián)用技術(shù)和透射電子顯微鏡的分析結(jié)果表明，HBc-L2融合蛋白在表達(dá)過程中自動(dòng)組裝形成穩(wěn)定的病毒樣顆粒；將純化后的HBc-L2蛋白免疫BALB/c小鼠可獲得針對(duì)L2抗原的高滴度抗體，且小鼠血清具有中和16和18型兩種假病毒的中和抗體活性。結(jié)論：HBc-L2病毒樣顆?？梢杂行У卦鰪?qiáng)L2抗原的免疫原性，并可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多型HPV的免疫保護(hù)力，是一個(gè)具有潛力的新型廣譜HPV疫苗。

[關(guān)鍵詞]人乳頭瘤病毒；L2抗原；乙肝病毒核心抗原；病毒樣顆粒；免疫原性；中和抗體

人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一種無包膜雙鏈DNA病毒，能引起子宮頸癌、生殖器疣等腫瘤疾病或癌癥[1]。宮頸癌在婦女中發(fā)生率位列第二，在發(fā)展中國家發(fā)生率明顯高于發(fā)達(dá)國家。統(tǒng)計(jì)表明，我國每年新增宮頸癌患者約15萬人左右，且年輕患者比例上升明顯[2]。

近年來，運(yùn)用重組DNA技術(shù)制備基因工程HPV疫苗的研究獲得了突破性進(jìn)展[3]。L1與L2基因分別編碼HPV的主要及次要衣殼蛋白，L1蛋白約占衣殼蛋白80%以上，能自動(dòng)組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)；L2蛋白在衣殼蛋白中含量少于20%，且無法單獨(dú)形成VLP[4]。國外已上市或獲批的產(chǎn)品，如默沙東四價(jià)、九價(jià)加德西(Gardasil，HPV6,11,16,18；HPV6,11,16,18,31,33,45,52,58)與葛蘭素史克二價(jià)卉妍康(Cervarix，HPV16,18)均利用L1自身形成VLP結(jié)構(gòu)的原理進(jìn)行研制[5]。但這些疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴，無法廣泛滿足市場(chǎng)，尤其是發(fā)展中國家低收入人群的需求[6]。研究表明，接種氨基酸序列較為保守的L2蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生涵蓋多種血清型HPV的保護(hù)力，但L2蛋白或L2多肽本身免疫原性較低[7]。通過將L2與Toll樣受體2 (TLR2) 融合、在腺伴隨病毒顆粒骨架中插入L2多肽抗原或?qū)⒔?jīng)修飾的細(xì)菌鞭毛蛋白(Fha)與L2融合等方法均可以提高L2的免疫原性，并獲得具有中和多種血清型HPV的免疫血清[8-10]。本研究選用的兩個(gè)L2蛋白的N-端多肽在不同型的HPV間具有較強(qiáng)保守性，并在早期研究中被證實(shí)對(duì)HPV16、18、31具有一定交叉保護(hù)活性[11]。

重組的乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B virus core antigen，HBcAg或HBc)可在大腸桿菌中高效表達(dá)，易純化，并能自身組裝形成VLP。構(gòu)建合適的HBc與目標(biāo)抗原融合蛋白，將目標(biāo)抗原展示在HBc形成的VLP表面，能有效地提高目標(biāo)抗原的免疫原性[12]。ACAMBIS公司將流感M2e蛋白插入HBc制備了ACAM-FLU-A的新型通用型抗流感疫苗，該疫苗具有較好的免疫原性及保護(hù)性，并已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。除病毒疫苗之外，HBc載體還被廣泛運(yùn)用于細(xì)菌、寄生蟲等多種病原疫苗研究[13]。

本研究將兩段16型人乳頭瘤病毒L2抗原多肽(13～47位與65～81位氨基酸) 偶聯(lián)后作為抗原片段插入到HBc蛋白中，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白并自動(dòng)組裝成VLP。研究結(jié)果顯示，HBc-L2病毒樣顆粒顯著增強(qiáng)了L2多肽抗原的免疫原性，所獲得的小鼠血清具有中和16型與18型HPV的能力。此項(xiàng)研究為開發(fā)廣譜、低成本的宮頸癌疫苗提供了一個(gè)新途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1假病毒、細(xì)胞、菌株與動(dòng)物HPV16、HPV18假病毒與陽性血清由北京微谷生物醫(yī)藥有限公司饋贈(zèng)；293FT細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹勝波教授饋贈(zèng)；感受態(tài)BL21(DE3)、DH5α與T載體購自全式金生物技術(shù)有限公司；SPF級(jí)BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；pET9a載體、pFN2K (GST) Flexi Vector購自Promega公司。

1.1.2試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自Gibco公司；HRP-羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、NdeⅠ、PmeⅠ與AsiSⅠ購自New EnglandBiolabs公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；Sepharose CL-4B購自GE公司，GST SEPHAROSE購自索萊寶公司；蛋白純化儀為Akta Prime Plus(GE公司)；流式細(xì)胞儀為Millipore guava easyCyte HT，熒光顯微成像系統(tǒng)為尼康TE2000U，透射電子顯微鏡為FEI Tecnai 20。

1.2方法

1.2.1表達(dá)載體的構(gòu)建本研究中采用的HBc蛋白為去掉C-端164～183位氨基酸的截短蛋白，取而代之的是一個(gè)半胱氨酸。在HBc蛋白178位置上插入了兩個(gè)抗原片段，分別為L2蛋白13～47位和65～81位氨基酸片段。插入到HBc的L2多肽序列為ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIA-DQILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPT。

融合基因(包括兩端的BamHⅠ和NdeⅠ酶切位點(diǎn))委托Life Technology公司合成構(gòu)建。將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)BamHⅠ和NdeⅠ雙酶切后回收目的基因，然后與經(jīng)同樣酶切的載體質(zhì)粒pET9a連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取并純化卡那霉素抗性菌落；陽性克隆經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將獲得的HBc-L2融合基因的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET9a-HBc-L2。

委托Invitrogen公司合成以下兩個(gè)DNA引物：5′-GCGATCGCTCAACTTTATAAAACATGCAAACAG-3′與5′-GTTTAAACTTAAACCTTAGGTATAATGTC-AGGT-3′。以L2融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pET9a-HBc-L2為模板，加入上述引物，PCR擴(kuò)增L2抗原編碼片段。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行AsiSⅠ和PmeⅠ雙酶切，膠回收L2目的條帶，將其與經(jīng)同樣酶切的載體質(zhì)粒pFN2K (GST) Flexi Vector連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，挑取卡那霉素抗性菌落，陽性克隆經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將獲得的表達(dá)質(zhì)粒命名為pGST-L2。

1.2.2重組融合蛋白的表達(dá)與純化將表達(dá)質(zhì)粒pET9a-HBc-L2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，挑取卡那霉素抗性菌落，純化后接種LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，在培養(yǎng)液中加入20%甘油，分裝后于-80℃保存菌種。取凍存菌種接種至10 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖菌過夜復(fù)蘇；轉(zhuǎn)接入400 ml新鮮培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.6～0.7時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，25℃誘導(dǎo)4 h；離心收集菌體，用TGE buffer(50 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5%甘油)重懸細(xì)胞；超聲破碎后離心收集上清，加入10% w/v (NH4)2SO4沉淀蛋白，用TGE buffer重懸沉淀，收集重懸液并用0.22 μm濾膜過濾，然后用100 kD膜包超濾濃縮。用CL-4B凝膠對(duì)濃縮液進(jìn)一步分離純化，收集目的蛋白。

將表達(dá)質(zhì)粒pGST-L2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞獲得GST-L2表達(dá)菌株。取凍存菌種接種10 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖菌過夜復(fù)蘇；轉(zhuǎn)接入400 ml新鮮培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.6～0.7時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)4 h；離心收集菌體，用PBS重懸細(xì)胞；超聲破碎后離心收集沉淀。加入200 ml 8 mol/L尿素過夜溶解包涵體，離心收集上清，濃度梯度透析至PBS中，經(jīng)GST SEPHAROSE柱純化，收集目的蛋白。

1.2.3病毒樣顆粒大小和形態(tài)的分析鑒定采用分子篩高效液相色譜(SEC-HPLC)及HPLC-多角度激光光散射(MALS)聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白純度和VLP顆粒大小。激光散射儀與色譜分離系統(tǒng)連接，將泵頭放入經(jīng)0.22 μm過濾并超聲后的流動(dòng)相后，流速調(diào)至0.1 ml/min，柱體平衡后分別對(duì)BSA和待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

委托中國科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)生物成像中心采用透射電子顯微鏡進(jìn)行VLP形態(tài)觀察。

1.2.4小鼠免疫與血清樣本制備分別對(duì)兩個(gè)批次HBc-L2(HBc-L2-1與HBc-L2-2)病毒樣顆粒樣品和一批GST-L2融合蛋白樣品進(jìn)行免疫原性研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為體重10～12 g的BALB/c小鼠，共104只。每批HBc-L2 VLP樣品設(shè)四個(gè)濃度組，分別為20、10、5、1 μg/只，每組10只小鼠；GST-L2樣品設(shè)兩個(gè)濃度，分別為20、10 μg/只，每組7只；另設(shè)陰性對(duì)照組，10只小鼠，注射生理鹽水。所有組別均在0天皮下注射500 μl對(duì)應(yīng)樣品，第14天、28天分別進(jìn)行第二和第三次免疫。分別在免疫第28、42天采血，6 000 r/min離心8 min，分離血清，-20℃暫存。

1.2.5間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)配制5 μg/ml GST-L2蛋白溶液，100 μl/孔包被酶標(biāo)板，4℃過夜。0.05%Tween PBS 洗3次，加入1%BSA 200 μl/孔，37℃孵育2 h；PBST洗3次，加入待檢血清(HBc-L2實(shí)驗(yàn)組)100 μl/孔，37℃孵育1 h；PBST洗3次，加入HRP-羊抗鼠IgG 100 μl/孔，37℃孵育1 h；PBST洗5次，加入TMB底物顯色10～15 min；每孔加入50 μl的2 mol/L H2SO4終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450讀數(shù)。檢測(cè)GST-L2融合蛋白免疫后獲得的血清時(shí)，采用HBc-L2包被酶標(biāo)版，檢測(cè)步驟同上。

1.2.6HPV中和抗體檢測(cè)在96孔細(xì)胞板每孔中加入100 μl 293FT細(xì)胞懸浮液，含1.5×104個(gè)細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)6 h。待測(cè)血清(HBc-L2三免血清)經(jīng)56℃滅活30 min后按1∶15、1∶30、1∶60、1∶120進(jìn)行系列稀釋，陰性血清(未免疫小鼠血清)處理后僅進(jìn)行1∶15稀釋。根據(jù)假病毒提供方的研究數(shù)據(jù)，分別對(duì)PsV16和PsV18進(jìn)行1∶200和 1∶100稀釋。將假病毒和血清按1∶1進(jìn)行混合，置于4℃共孵育60 min，再將混合液加入已培養(yǎng)6 h的細(xì)胞板中，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)[14]。72 h培養(yǎng)結(jié)束后用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達(dá)。觀察結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入0.25%胰酶20 μl，37℃消化5 min，每孔加入200 μl 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至新的96孔板，用Millipore guava easyCyte HT 流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間差異選用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異具有顯著性。

2結(jié)果

2.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建編碼HBc-L2的融合基因長度為663 bp，表達(dá)出的融合蛋白大小約為24 kD。如圖1A所示，將構(gòu)建的HBc-L2表達(dá)載體pET 9a-HBc-L2進(jìn)行BamHⅠ和NdeⅠ雙酶切，得到兩個(gè)大小分別約為670 bp和4 300 bp DNA片段，與融合基因編碼片段和pET9a載體大小相符。經(jīng)驗(yàn)證，GST-L2的表達(dá)載體經(jīng)AsiSⅠ和PmeⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳，條帶大小分別約為107 bp和3 765 bp，也與預(yù)期的質(zhì)粒大小及基因片段一致(圖1B)。

圖1　表達(dá)載體雙酶切鑒定圖Fig.1　Restriction digestion of expression plasmids Note: A.Digestion of pET9a-HBc-L2 with BamHⅠ and NdeⅠ;B.Digestion of pGST-L2 with AsiSⅠ and PmeⅠ.

2.2HBc-L2重組蛋白的表達(dá)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，離心收集菌體；超聲破碎細(xì)胞后分別對(duì)上清和沉淀中的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳結(jié)果(圖2)顯示，IPTG誘導(dǎo)后上清和沉淀樣品中均出現(xiàn)了一條約為24 kD的明顯蛋白條帶，與HBc-L2融合蛋白的理論分子量相符。因此，HBc-L2融合基因可在大腸桿菌有效表達(dá)，獲得產(chǎn)物主要為可溶性蛋白，少部分形成包涵體。

2.3蛋白純化與病毒樣顆粒的鑒定對(duì)細(xì)胞破碎上清進(jìn)行硫酸銨沉淀處理(圖3A)，復(fù)溶并超濾濃縮，并用CL-4B分子篩層析進(jìn)一步純化，在外水體積收集到蛋白峰(圖3B，峰1)；對(duì)所獲樣品進(jìn)行蛋白電泳，結(jié)果如圖3C所示，樣品中目的蛋白純度大于80%，主要雜質(zhì)為分子量約30 kD的蛋白。

用SEC-HPLC方法對(duì)純化的HBc-L2融合蛋白進(jìn)行分析。HBc-L2分子量約為24 kD，而結(jié)果顯示HBc-L2蛋白的出峰時(shí)間遠(yuǎn)早于66 kD的BSA(出峰時(shí)間約23 min)，表明該蛋白并不以單體形式存在，而是自組裝成大分子結(jié)構(gòu)(圖4A)；SEC-HPLC-MALS聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步表明，獲得的HBc-L2融合蛋白分子量大，且分布集中、結(jié)構(gòu)均一(圖4B)。

通過透射電子顯微鏡對(duì)兩批純化的HBc-L2進(jìn)行觀察(圖5)，鏡下可見大量均一分布、直徑約為30 nm的圓形顆粒，與報(bào)道的HBc病毒樣顆粒相符，表明構(gòu)建的融合蛋白HBc-L2能有效自動(dòng)包裝形成大分子病毒樣顆粒。

2.4血清抗體效價(jià)對(duì)小鼠二次與三次免疫后的血清進(jìn)行抗L2抗體效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。二次免疫后，低劑量組(1或5 μg)血清中滴度達(dá)到104左右，而高劑量組(10或20 μg)抗體滴度已接近或超過105(圖6A)；三次免疫后，各劑量組抗體滴度較二免結(jié)果略有增加(圖6B)，但沒有顯著差異(P>0.05)。比較不同批次的樣品，HBc-L2-2較HBc-L2-1的免疫原性似乎更強(qiáng)，但兩批間差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果表明，HBc-L2具有良好的免疫原性，二次免疫即可刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗L2抗體，且不同批次樣品的結(jié)構(gòu)和免疫原性較一致。

圖2　HBc-L2誘導(dǎo)表達(dá)鑒定Fig.2　Expression of HBc-L2 after inductionNote: M.Marker;Lane 1.Soluble fraction of cell lysate;Lane 2.Insoluble fraction of cell lysate.

圖6C為GST-L2融合蛋白免疫小鼠所得結(jié)果。高劑量(10和20 μg)GST-L2蛋白三次免疫后，血清中抗L2的抗體效價(jià)分別為102或103，遠(yuǎn)低于HBc-L2的免疫效果。因此，HBc-L2形成的VLP可有效地增強(qiáng)L2抗原的免疫原性。

2.5HPV中和抗體檢測(cè)小鼠免疫血清對(duì)兩種HPV假病毒(PsV16與PsV18)的中和效力，初步評(píng)價(jià)HBc-L2疫苗的保護(hù)性和廣譜性。如圖7所示，PsV16與PsV18能有效感染293FT細(xì)胞，陰性對(duì)照血清(1∶15倍稀釋)對(duì)假病毒感染效力無影響，鏡下可觀察到大量感染后表達(dá)熒光的細(xì)胞。當(dāng)將小鼠免疫血清(1∶15倍稀釋)與PsV16、PsV18分別共孵育72 h后，PsV16與PsV18的感染能力明顯被抑制，鏡下僅能找到極少表達(dá)熒光的細(xì)胞。1∶30、1∶60和1∶120 稀釋度的免疫血清與PsV16或PsV18共孵育后，也對(duì)兩個(gè)假病毒的感染效力有不同程度的抑制(結(jié)果未顯示)。

圖3　HBc-L2融合蛋白純化Fig.3　Purification of HBc-L2 fusion proteinNote: A.SDS-PAGE analysis of samples before and after ammonia sulfate precipitation;B.SDS-PAGE analysis of samples before and after CL-4B gel filtration；C.Purification of HBc-L2 by CL-4B gel filtration chromatography;A：M.Marker;1.Cell lysate before induction;2.Cell lysate after induction;3.supernatant after Ammonium sulfate precipitation;4.TGE suspension of Ammonium sulfate precipitation;5.Precipitate after centrifugation;6.Supernatant after centrifugation;B：M.Marker；1.HBc-L2 before CL-4B gel filtration;2.HBc-L2 after CL-4B gel filtration.

圖4　HBc-L2融合蛋白分子大小分析Fig.4　Analysis of size of HBc-L2 fusion protein Note: A.SEC-HPLC analysis of HBc-L2;B.SEC-HPLC-MALS analysis of HBc-L2.

圖5　HBc-L2 病毒樣顆粒電子透鏡鑒定Fig.5　Observation of HBc-L2 virus-like particles by TEMNote: A.HBc-L2-1;B.HBc-L2-2.

圖6　血清中抗L2抗體滴度檢測(cè)Fig.6　Anti-L2 antibody titers in mouse seraNote: A.After two injections with HBc-L2;B.After three injections with HBc-L2;C.After three injections with GST-L2.

將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移后進(jìn)行流式分析，結(jié)果顯示陰性對(duì)照血清對(duì)假病毒無中和作用，PsV16與其共孵育后感染細(xì)胞，約有16%細(xì)胞表達(dá)熒光。當(dāng)PsV16與1∶15、1∶30、1∶60、1∶120 四個(gè)梯度稀釋的小鼠免疫血清共孵育后，檢測(cè)出感染熒光細(xì)胞比例分別下降至4.48%、7.54%、9.32%與11.23%。PsV18與陰性血清反應(yīng)后感染細(xì)胞，可以檢測(cè)到約11%的細(xì)胞表達(dá)熒光。當(dāng)PsV18與4個(gè)梯度稀釋的小鼠免疫血清共孵育后感染細(xì)胞，所檢測(cè)熒光細(xì)胞比例分別為3.46%、4.81%、9.61%、11.96%。

圖7　HPV假病毒中和試驗(yàn)熒光采集Fig.7　Fluorescence assay of HPV pseudovirion neutralization

綜合顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，HBc-L2免疫小鼠后獲得的血清具有中和16型HPV的能力，并對(duì)18型HPV病毒也有較強(qiáng)交叉中和活性。

3討論

引發(fā)宮頸癌的人乳頭瘤病毒主要包括HPV6、11、16、18、31、33、45、52與58等血清型[15]。國外已上市的疫苗均采用主要衣殼蛋白L1作為抗原主要成分，但L1蛋白具有較強(qiáng)型特異性，不能覆蓋其他血清型的病毒[16,17]，需分別制備不同型的疫苗組分以形成多價(jià)制劑。L1蛋白在昆蟲細(xì)胞與酵母細(xì)胞中表達(dá)量低，制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高[18]。而世界上約有80%的宮頸癌病例發(fā)生于發(fā)展中國家，昂貴的HPV疫苗無法使這些地區(qū)的人群完全受益[19]。因此，開發(fā)更廣譜、更經(jīng)濟(jì)的宮頸癌疫苗勢(shì)在必行。

研究表明，次要衣殼蛋白L2雖不屬于維持病毒結(jié)構(gòu)的主要蛋白，在病毒表面含量相對(duì)較少，但能與次級(jí)病毒受體結(jié)合從而促進(jìn)病毒基因組從胞內(nèi)體向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與乳頭瘤病毒感染有重要聯(lián)系[20]。但L2免疫原性相對(duì)較弱，極大限制了基于L2抗原的疫苗開發(fā)。近年來，人們開展了大量的研究以增強(qiáng)L2抗原的免疫原性和保護(hù)性。Tumban等[21]將HPV16的L2短肽插入到編碼MS2病毒樣顆粒的質(zhì)粒后，小鼠模型免疫原性得到明顯提高。Tyler等[22]將含有L2蛋白整合到Qβ噬菌體VLP上，免疫小鼠血清能有效中和PsV16、18、31、45、58多種血清型假病毒，證實(shí)了以L2制備的HPV疫苗具有更廣泛的中和保護(hù)力。

本研究中，我們將兩個(gè)16型HPVL2蛋白N-端具有交叉保護(hù)功能的多肽抗原插入到HBc蛋白中，在大腸桿菌中表達(dá)獲得HBc-L2融合蛋白，并證明經(jīng)純化的HBc-L2自動(dòng)組裝形成了VLP結(jié)構(gòu)。由于HBc-L2可在細(xì)菌中高效表達(dá)，VLP純化過程簡單且收率高，生產(chǎn)成本將能得到有效控制。在小鼠試驗(yàn)中，HBc-L2二免及三免血清中針對(duì)L2的特異性抗體滴度能達(dá)到105～106，免疫效果遠(yuǎn)高于不能形成VLP結(jié)構(gòu)的GST-L2融合蛋白。因此，將L2抗原多肽展示在HBc形成的VLP表面上能有效增強(qiáng)L2抗原的免疫原性。通過假病毒中和試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了HBc-L2 VLP免疫后血清不僅可以顯著地中和16型HPV的感染效力，對(duì)18型HPV也有較強(qiáng)中和活性。綜上，HBc-L2 VLP可能成為一個(gè)生產(chǎn)成本低，且對(duì)不同血清型有廣泛覆蓋率的新型HPV疫苗。

HPV外殼表面主要是L1蛋白，L2蛋白數(shù)量相對(duì)較少，因此，基于L2抗原的HPV疫苗能否達(dá)到足夠保護(hù)性是一個(gè)需要在臨床試驗(yàn)中回答的關(guān)鍵問題。HBc-L2 VLP良好的免疫原性，以及獲得的免疫血清對(duì)HPV16和HPV18具有交叉中和活性，無疑為該疫苗的進(jìn)一步開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為基于L2蛋白的疫苗開發(fā)提供了有力支持。我們將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)添加佐劑是否會(huì)增強(qiáng)HBc-L2VLP的免疫原性，以及體內(nèi)動(dòng)物模型中該疫苗是否能有效降低HPV的感染率等問題進(jìn)行研究。我們也將進(jìn)一步改進(jìn)HBc-L2的組成和結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其免疫原性，使該疫苗可以覆蓋更多血清型的HPV。

參考文獻(xiàn)：

[1]姜志欣，吳玉磷.HPV感染及預(yù)防性HPV疫苗研究[J].中國計(jì)劃生育學(xué)雜志，2008，16(5)：315-317.

[2]Yu DY,Xuexinchun.The relation between human papilloma virus and cervical cancer[J].Port Health Control,2003,8(1):40-45.

[3]Gong YL,Su DM,Liu YA.Construction of prophylactic HPV vaccines using genetic engineering technology[J].China Biotechnol,2008,28(9):130-134.

[4]Wang D,Li Z,Xiao J,etal.Identification of broad-genotype HPV L2 neutralization site for Pan-HPV vaccine development by a cross-neutralizing antibody[J].PLoS One,2015,10(4):e0123944.

[5]Printz C.FDA approves Gardasil 9 for more types of HPV[J].Cancer,2015,121(8):1156-1157.

[6]Cladel NM,Budgeon LR,Balogh KK,etal.A novel pre-clinical murine model to study the life cycle and progression of cervical and anal papillomavirus infections[J].PLoS One,2015,10(3):e0120128.

[7]Chen X,Liu H,Zhang T,etal.A vaccine of L2 epitope repeats fused with a modified IgG1 Fc induced cross-neutralizing antibodies and protective immunity against divergent human papillomavirus types[J].PLoS One,2014,9(5):e95448.

[8]Alphs HH,Gambhira R,Karanam B,etal.Protection against heterologous human papillomavirus challenge by a synthetic lipopeptide vaccine containing a broadly cross-neutralizing epitope of L2[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(15):5850-5855.

[9]Nieto K,Weghofer M,Sehr P,etal.Development of AAVLP(HPV16/31L2) particles as broadly protective HPV vaccine candidate[J].PLoS One,2012,7(6):e39741.

[10]Kalnin K,Tibbitts T,Yan Y,etal.Low doses of flagellin-L2 multimer vaccines protect against challenge with diverse papillomavirus genotypes[J].Vaccine,2014,32(28):3540-3547.

[11]Conway MJ,Cruz L,Alam S,etal.Cross-neutralization potential of native human papillomavirus N-terminal L2 epitopes[J].PLoS One,2011,6(2):e16405.

[12]Paul Pumpens，Urich R,Sasnauska K,etal.Medicinal protein engineering[M].Boca Raton London New York:CPC Press,2008:205-248.

[13]楊星鈺，薄洪，舒躍龍.乙肝病毒核心抗原作為載體用于病毒樣顆粒疫苗研究的主要進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào)，2012,28(3)：311-316.

[14]吳雪伶，聶建輝，張春濤，等.人乳頭瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析[J].病毒學(xué)報(bào)，2008,24(3)：36-41.

[15]Munoz N,Bosch FX,De Sanjose S,etal.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer[J].N Engl J Med,2003,348(6):518-527.

[16]Wheeler CM,Kjaer SK,Sigurdsson K,etal.The impact of quadrivalent human papillomavirus (HPV;types 6,11,16,and 18) L1 virus-like particle vaccine on infection and disease due to oncogenic nonvaccine HPV types in sexually active women aged 16-26 years[J].J Infect Dis,2009,199(7):936-944.

[17]Kemp TJ,Hildesheim A,Safaeian M,etal.HPV16/18 L1 VLP vaccine induces cross-neutralizing antibodies that May mediate cross-protection[J].Vaccine,2011,29(11):2011-2014.

[18]Roden R,Wu TC.How will HPV vaccines affect cervical cancer?[J].Nat Rev Cancer,2006,6(10):753-763.

[19]Karanam B,Jagu S,Huh WK,etal.Developing vaccines against minor capsid antigen L2 to prevent papillomavirus infection[J].Immunol Cell Biol,2009,87(4):287-299.

[20]Yang R,Day PM,Yutzy WH,etal.Cell surface-binding motifs of L2 that facilitate papillomavirus infection[J].J Virol,2003,77(6):3531-3541.

[21]Tumban E,Muttil P,Escobar CA,etal.Preclinical refinements of a broadly protective VLP-based HPV vaccine targeting the minor capsid protein,L2[J].Vaccine,2015,33(29):3346-3353.

[22]Tyler M,Tumban E,Dziduszko A,etal.Immunization with a consensus epitope from human papillomavirus L2 induces antibodies that are broadly neutralizing[J].Vaccine,2014,32(34):4267-4274.

[收稿2015-08-25修回2015-09-28]

(編輯倪鵬)

Study of a virus-like particle vaccine containing N-terminal epitopes of human papilloma virus L2 protein

JIANGRong，LIJun-Qiang,YANGMing-Ming,ZHUTao,YUXue-Feng,SHAOZhong-Qi.TianjinCanSinoBiotechnologyInc.

TianjinCorporateKeyLaboratoryofRespiratoryBacterialRecombinantandConjugateVaccine,Tianjin300457,China

[Abstract]Objective:To prepare a virus-like particle (VLP),containing Hepatitis B virus core antigen (HBcAg) and N-terminal peptides of the L2 protein of human papilloma virus (HPV),and investigate the immunogenicity of the VLP in mice and the protection against different strains of HPV.Methods: A fusion gene was synthesized to insert a DNA fragment,coding for the N-terminal epitopes of the L2 protein of HPV16,into the HBcAg coding sequence;HBc-L2 fusion protein was highly expressed in E.coli using the pET9a and BL21(DE3) expression system;the purified fusion protein was used to immunize BALB/c mice and antibody titers against the L2 epitopes in mouse sera were determined by indirect ELISA;the levels of neutralizing antibodies against both HPV16 and 18 were also analyzed.Results: HBc-L2 fusion protein was expressed in E.coli and purified，with the purity >80%,by ammonium sulfate precipitation and CL-4B gel filtration;analysis of the purified fusion protein,using size exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering detection (SEC-MALS) and electron microscope,revealed that HBc-L2 was assembled into a stable VLP structure automatically following its expression;immunization of BALB/c mice with the purified VLPs resulted in high antibody titers in mouse sera against the L2 epitopes;furthermore,it was demonstrated that the sera from the immunized mice had neutralization activities against both HPV16 and HPV18.Conclusion: The immunogenicity of the L2 epitopes was highly enhanced by the construction of HBc-L2 fusion protein and the formation of the VLP structure;the fusion protein was also capable of inducing protections against different serotypes of HPV,therefore,it could be a potential HPV vaccine with a broad coverage and low production cost.

[Key words]Human papillomavirus;L2 peptide;Hepatitis B virus core antigen;Virus-like particles;Immunogenicity;Neutralization antibody

中圖分類號(hào)R373.9R392-33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0366-06

作者簡介：蔣蓉(1986年-)，女，碩士，高級(jí)技術(shù)員，主要從事病原微生物免疫學(xué)方面研究，E-mail:rong.jiang@cansinotech.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：邵忠琦(1962年-)，男，博士，研發(fā)總監(jiān)，主要從事疫苗研發(fā)方面研究，E-mail:zhongqi.shao@cansinotech.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.016