高雙英　吳　靜　楊貴麗

(武漢科技大學醫(yī)院檢驗科，武漢430081)

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結腸癌腫瘤相關巨噬細胞的浸潤和MMP-2的表達、血管生成關系的研究

高雙英吳靜①楊貴麗②

(武漢科技大學醫(yī)院檢驗科，武漢430081)

[摘要]目的：通過對不同分化程度的結腸腺癌中巨噬細胞和血管的分布和計數(shù)，利用免疫學方法檢測腫瘤中MMP-2的表達，揭示結腸癌中巨噬細胞、MMP-2的表達和血管生成的關系。方法：用免疫組化染色的方法對79例結腸癌患者的腫瘤相關巨噬細胞的浸潤情況、微血管的數(shù)目進行計數(shù)和分析并檢測巨噬細胞中MMP-2的表達，根據(jù)結果對巨噬細胞數(shù)目、血管數(shù)目、臨床病理參數(shù)、MMP-2的表達之間關系進行統(tǒng)計學分析。結果：結腸癌中巨噬細胞被鼠抗人CD68單克隆抗體標記為棕黃色。巨噬細胞的數(shù)目明顯高于正常組(F=412.04，P<0.05)；巨噬細胞的數(shù)目差異在結腸癌的分化程度和Duck’s分期中均具有統(tǒng)計學意義(t=10.80和F=412.04，P<0.05)；微血管的密度(MVD)的差異在結腸癌的Duck’s分期有統(tǒng)計學的意義(t=7.35，P<0.05)，有淋巴結轉移的結腸癌患者中MVD高于無淋巴結轉移者(t=6.77，P<0.05)；MMP-2在結腸癌中的表達為強陽性；有淋巴結轉移者中MMP-2的表達顯著高于無淋巴結轉移者(t=10.91，P<0.05)；MMP-2的表達和腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)的數(shù)目和MVD均存在正相關的關系(r值分別為0.451、0.672，P<0.05)。結論：MMP-2和TAMs與結腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切的關系。結腸癌中，TAMs可通過上調MMP-2的表達，促進腫瘤微血管的形成，從而促進腫瘤的生長和轉移。

[關鍵詞]腫瘤相關巨噬細胞；結腸癌；血管生成；MMP-2

腫瘤的生長和轉移離不開腫瘤血管的營養(yǎng)作用，腫瘤血管的形成是一切惡性腫瘤生物學行為的基礎。近年來有研究表明腫瘤相關巨噬細胞與腫瘤中微血管的形成具有密切的聯(lián)系[1]。腫瘤相關巨噬細胞通過釋放一些炎癥因子、細胞因子、腫瘤因子、酶等促進腫瘤的生長和轉移[2]。但結腸癌中腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)和MMP-2在促進腫瘤血管生成中的作用及關系，目前國內外少有報道。本文采用免疫組化、流式細胞術的方法，分析巨噬細胞、腫瘤微血管在結腸癌中的數(shù)量和分布及MMP-2在結腸癌中的表達，初步探討一下結腸癌中巨噬細胞和腫瘤血管形成的初步關系和可能的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料選擇2013年3月至2015年5月間經我院外科手術切除的79例結腸癌標本，經病理標本查實均為腺癌，且術前均未進行針對腫瘤有關的治療，入選患者均簽署了知情同意書。79例結腸癌患者中有51名男性(64.56%)，28名女性(35.44%)，年齡36～67歲，平均年齡為(51.25±4.47)歲。經病理查實，分化程度：高分化23例，中分化37例，低分化19例。Duck’s 分期：A、B期43例，C、D期36例。有淋巴結轉移者34例，另外取10例正常結腸組織作為對照。

1.1.2試劑鼠抗人CD68單克隆抗體(克隆系KPI，工作濃度為1∶100)(購于杭州言科生物技術有限公司)，兔抗人CD34多克隆抗體(工作濃度為1∶50)，兔抗人MMP-2多克隆抗體(工作濃度1∶40)(以上兩者均購于上海滬峰化工有限公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組化將以上標本均進行常規(guī)脫水，福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片切4 μm厚切片。正常組織和結腸腺癌組均進行免疫組化染色，采用常規(guī)的免疫組化SP的方法。嚴格按照試劑盒上的步驟和說明進行操作，嚴格控制染色的時間和溫度，每次染色都采用PBS代替一抗作為陰性對照。用鼠抗人CD68單克隆抗體(克隆系KPI)來標記腫瘤中的巨噬細胞(工作濃度為1∶100)。兔抗人CD34多克隆抗體標記血管內皮細胞(工作濃度為1∶50)，兔抗人MMP-2多克隆抗體標記MMP-2(工作濃度1∶40)。

1.2.2結果判定①血管的分布和計數(shù)：微血管密度的測定采用Weidner的方法[3]，用CD34標記血管內皮細胞在光鏡下進行觀察。先在40倍或者100倍鏡下找到腫瘤中具有高密度的被染色標記的毛細血管和小血管分布的區(qū)域(即熱點區(qū))，然后在200倍鏡下(20倍物鏡和10倍目鏡，0.739 mm2每視野)進行微血管的計數(shù)。任何和鄰近的微血管、腫瘤細胞和其他結締組織細胞成分分開的棕染的血管內皮細胞或者血管內皮細胞簇，被判定為一個單獨的、可計數(shù)的微血管[4]；②巨噬細胞的分布和計數(shù)：用CD68標記巨噬細胞，胞膜被染為棕黃色的為CD68陽性的巨噬細胞，在光鏡下觀察其一般形態(tài)及分布后，參考Leek和Lewis的方法對巨噬細胞的數(shù)量進行計數(shù)[5]。即在100倍鏡(10×10)下找到視野中巨噬細胞在腫瘤中密度最高的三個區(qū)域，即熱點區(qū)域，然后在400倍鏡下(10×40)下對巨噬細胞進行計數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計學分析；③MMP-2表達的判斷標準：以細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為表達陽性。在400鏡下選擇三個腫瘤視野下按照陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)<30%為陰性表達，>30%為陽性表達。

2結果

2.1免疫染色的結果正常結腸黏膜組織中，MMP-2的表達較少，僅基底層有少量染色，巨噬細胞的表達少，微血管的數(shù)目較少且分布較為均勻。在結腸癌組織的免疫組化染色中，MMP-2表達陽性，呈棕黃色顆粒，主要在癌組織的胞質和胞膜表達，分布多集中在腫瘤邊緣(圖1A)。以巨噬細胞特異性抗體CD68標記的巨噬細胞表達陽性呈棕黃色顆粒，主要位于巨噬細胞的胞膜和胞漿上，多分布于腫瘤的間質和壞死區(qū)，細胞體積較大，形態(tài)多樣而不規(guī)則(圖1B)。CD34定位于血管內皮細胞上，可見癌組織中血管內皮被染成棕黃色，血管數(shù)目明顯增多，分布明顯不均，多位于癌組織的邊緣部，血管呈條索狀(圖 1C)。

圖1　免疫染色的結果(SP，×100)Fig.1　Results of immune staining(SP，×100)Note: A.Positive expression of MMP-2,MMP-2 is primarily expressed in cytoplasm and cell membrane,distributed primarily at the periphery of the tumor;B.Macrophages in colon carcinoma,macrophages were stained to brown yellow,the cells has large column,irregular form and are mainly distributed in the mesenchyme of the tumor and necrotic area;C.Blood capillaries labeled by CD34 in colon carcinoma.

ClinicopathologicalparametersCountingofmacrophagest/FPvalueGenderMale(n=51)47.74±4.861.240.217Female(n=28)46.38±4.23Age≥50(n=42)48.31±3.640.490.629<50(n=37)47.89±4.05DegreesofdifferentiationHigh(n=23)39.43±5.7610.800.000Medium(n=37)45.14±6.02Low(n=19)47.21±5.34Duck’sstagingA,Bstage(n=43)46.74±3.87412.040.000C,Dstage(n=36)47.33±4.75Normalgroup(n=10)7.34±2.10

表2結腸癌中MMP-2的表達和臨床病理學參數(shù)之間的關系[n,%]

Tab.2Relationship of expression of MMP-2 in colon carcinoma and clinicopathological parameters[n,%]

ClinicopathologicalparametersnExpressionofMMP-2PositivenumbersPositiverate%χ2PGenderMale513568.630.010.944Female281967.86Age≥50422969.050.020.888<50372567.57Duck’sstagingA,Bstage432353.499.640.002C,Dstage363186.11MetastasisoflymphnodesYes343088.2410.910.001No452453.33

2.2巨噬細胞的計數(shù)與臨床病理學參數(shù)之間的關系巨噬細胞的數(shù)量在結腸癌中的表達明顯地高于正常組(P<0.05)。在腫瘤的分化和Duck’s分期中，巨噬細胞數(shù)目的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而巨噬細胞的數(shù)目在年齡、性別方面經統(tǒng)計學分析后無顯著性關系(P>0.05)。見表1。

2.3MMP-2的表達與臨床病理學參數(shù)之間的關系MMP-2的表達在結腸癌中的表達明顯地高于正常組(P<0.05)。在腫瘤的分期中，MMP-2的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有淋巴結轉移的結腸癌患者MMP-2的表達顯著高于無淋巴結轉移組(P<0.05)，而MMP-2的表達在年齡、性別方面經統(tǒng)計學分析后無顯著性關系(P>0.05)。見表2。

ItemnMVDtvaluePGroupsAddnocarcinomaofColon7926.47±3.1213.230.000Normalgroups1012.73±2.86MetastasisoflymphnodesYes3428.43±2.546.770.000No4524.31±2.78Duck’sstagingA,Bstage4323.76±1.997.350.000C,Dstage3627.53±2.57

ItemExpressionofMMP-2Positive(n=54)Negative(n=25)tPCountingofmacrophages45.23±1.7938.44±1.9415.270.000MVD28.36±2.5323.04±2.179.070.000

2.4結腸腺癌中不同組織中微血管密度的分布不同組織中微血管密度差異具有統(tǒng)計學意義。結腸腺癌中微血管密度顯著高于正常組(P<0.05)；在有淋巴結轉移的結腸癌中，微血管數(shù)目表達的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在結腸癌的不同分期中，微血管數(shù)目的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.5結腸腺癌中MMP-2的表達和巨噬細胞計數(shù)和微血管密度之間的關系在結腸癌MMP-2表達陽性組中，巨噬細胞的數(shù)目以及MVD明顯高于正常組，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MMP-2的表達與MVD、巨噬細胞的數(shù)目存在正相關的關系(r=0.672、0.451，P<0.05)。見表4。

3討論

本研究在檢測結腸癌組織中巨噬細胞的計數(shù)和分布時發(fā)現(xiàn)，癌組織中有大量的TAMs浸潤，細胞大而形態(tài)不規(guī)則，多分布于腫瘤的間質和壞死的區(qū)域。同時，巨噬細胞的浸潤程度和微血管的密度在腫瘤的不同分化程度、Duck’s分期以及有無淋巴結轉移中的比較中其差異都具有統(tǒng)計學的意義(P<0.05)。這和白明華等[6]在結腸癌中的研究結果相一致。巨噬細胞來源于血液中的單核細胞。TAMs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重的作用[7]：一是巨噬細胞作為免疫細胞能夠發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用；二是巨噬細胞有促進腫瘤生長的作用。有研究表明，被腫瘤細胞激活的巨噬細胞，能夠釋放廣泛的生長因子、蛋白水解酶、細胞因子和炎癥介質，其中許多的因子都是腫瘤轉移的關鍵因子[8]。Zeisberger[9]用氯膦酸鹽脂質體特異性地清除巨噬細胞后，可明顯抑制各種腫瘤細胞的生長和血管的生成。另外，也有研究表明TAMs能夠誘導免疫抑制、腫瘤耐藥性的形成來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。研究發(fā)現(xiàn)通過陽離子多聚體對TAMs上Toll樣受體4(TLR-4)的激活作用可以轉變TAMs免疫耐受的表現(xiàn)型[11]。這說明TAMs在介導腫瘤的免疫耐受上有著重要的作用。巨噬細胞中的M2型能夠促進腫瘤的發(fā)展，有研究認為巨噬細胞可以通過促進IL-10的分泌，促進Treg/Th17的增加，從而促進腫瘤的生長和侵襲[12]。

在研究結果中，發(fā)現(xiàn)MMP-2在結腸癌組織中呈高度陽性表達，MMP-2主要分布在癌細胞的胞質和胞膜中，根據(jù)統(tǒng)計學分析，結腸癌中MMP-2的表達在不同腫瘤的分化程度、Duck’s分期以及有無淋巴結轉移中的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明MMP-2的過表達可能和腫瘤細胞的生長和轉移有關。此外，研究中也發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中TAMs的浸潤程度和MMP-2的表達具有較高的一致性。同時，在對MMP-2與微血管密度進行分析時發(fā)現(xiàn)在微血管較少的組織中MMP-2的表達明顯低于微血管數(shù)目較多的組織，且具有統(tǒng)計學的意義，說明MMP-2的過表達可能與腫瘤中血管的生成有密切的聯(lián)系。研究證明腫瘤相關巨噬細胞能夠生成大量的血管生成調節(jié)酶，如MMP-2、MMP-9、MMP-7和環(huán)氧和酶-2(COX-2)等[13]。腫瘤的侵襲和轉移需要建立在少數(shù)富含膠原蛋白的組織屏障的降解基礎上，其中，基膜是惡性腫瘤轉移的最大的、連續(xù)的物理性屏障[14]。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2能夠降解基膜中的主要成分——膠原蛋白Ⅳ，從而降解基膜[14]?；さ钠茐?，有利于構成血管所必需的內皮細胞的遷移，這是血管生成中最基本的過程[15]。此外，研究證明，MMP-2與多種惡性腫瘤形成有關，包括肝癌、胃癌、膀胱癌、腎細胞癌等等[16]。MMP-2被認為是血管生成中關鍵的因素之一。研究證明MMP-2可以刺激新生血管的形成，促使腫瘤細胞之間及腫瘤細胞與宿主細胞之間的黏附，激活其他MMPs，形成“瀑布效應”[17]。TIMPs是一組抑制MMPs活性的多功能因子，TIMPs可以激活E-Cadherin的表達，抑制腫瘤的發(fā)生[18]。通過檢驗結腸癌中的MMPs和TIMPs的表達，可以對結腸癌的風險進行評級并確定治療方案，從而達到防止結腸癌進一步轉移的目的[19]。

在研究中發(fā)現(xiàn)微血管的密度和腫瘤中巨噬細胞的浸潤程度呈明顯的正相關關系，TAMs浸潤程度高的腫瘤中MVD也相對較高[20]，說明巨噬細胞的浸潤可能有促進腫瘤中血管形成的作用。TAMs能夠釋放許多細胞因子如VEGF、IL-8、IL-10、MMP、TNF-α等等促進腫瘤的生長和轉移。有研究證明，TAMs分泌的TNF-α可促進IL-8、VEGF等血管生成因子的釋放[21]。而IL-8的過表達可以上調MMP-2的活性，促進細胞基質和基膜的降解，從而促進腫瘤的血管形成和轉移的過程[22]。

通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)在結腸癌中巨噬細胞的浸潤程度、微血管的密度和MMP-2的表達具有一定的一致性，三者之間具有密切的聯(lián)系。TAMs可能通過促進MMP-2在結腸癌中的過表達來促進腫瘤中的血管生成，進而促進腫瘤的生長轉移。但三者之間的關系及具體的作用機制還需要進一步探討。

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[收稿2015-08-25修回2015-09-11]

(編輯倪鵬)

A study on correlation of tumor-associated macrophages infiltration,MMP-2 expression and angiogenesis in colon carcinoma

GAOShuang-Ying,WUJing,YANGGui-Li.

DepartmentofLaboratoryMedicine,HospitalofWuhanScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430081,China

[Abstract]Objective:To study the correlation of tumor-associated macrophages infiltration,MMP-2 expression and angiogenesis in colon carcinoma by testing the MMP-2 through immunological methods,and counting of macrophages and distributing of vessels in colonic adenocarcinoma at different differential degrees.Methods: Analyze the infiltration of tumor-associated macrophages(TAMs),and count blood capillaries in 79 patients with colon carcinoma by immunohistochemical staining,detect the expression of MMP-2 in macrophages by immunological methods.Analyze the relationship among numbers of macrophages and vessels,clinical pathology and expression of MMP-2.Results: Macrophages in colon carcinoma were labeled to brown yellow by murine monoclonal antibody to human. The number of macrophages was markedly higher than normal group(F=412.04,P<0.05); Variance of macrophages number had statistical significance in differentiatial degrees and Duck′s staging of colon carcinoma(t=10.80 and F=412.04,P<0.05); variance of microvessel density(MVD) had statistical significance in Duck′s staging of colon carcinoma(t=7.35,P<0.05),MVD in colon carcinoma patients with lymphatic metastasis was higher than patients without lymphatic metastasis(t=6.77,P<0.05). Expression of MMP-2 in colon carcinoma showed strong positive. Expression of MMP-2 in patients with lymphatic metastasis was higher than patients without lymphatic metastasis(t=10.91,P<0.05). There was a positive relationship among MMP-2 expression,number of tumor-associated macrophages(TAMs) and MVD(r=0.451,0.672,P<0.05,respectively).Conclusion: MMP-2 and TAMs correlated closely with the development of colon carcinoma. TAMs in colon carcinoma can promote the angiogenesis,growth and metastasis of the tumor by up-regulating the expression of MMP-2.

[Key words]Tumor-associated macrophages(TAMs); Colon carcinoma; Angiogenesis; MMP-2

中圖分類號R735.34

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0336-05

通訊作者及指導教師：吳靜(1970-)，女，主管技師，主要從事臨床檢驗方面的研究。

作者簡介：高雙英(1971-)，女，主管技師，主要從事臨床檢驗方面的研究，E-mail:gaoshuangying8@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.009

①華潤武鋼總醫(yī)院檢驗科，武漢430080。

②武漢科技大學醫(yī)院內科，武漢430081。