余秀英　陳亞娟　巫鳳蘋　鄒琳琳　陳雨晗　黎友倫

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016)

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PLTP在香煙誘導(dǎo)A549細(xì)胞合成白介素8中的作用①

余秀英陳亞娟巫鳳蘋鄒琳琳陳雨晗黎友倫

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016)

[摘要]目的：研究磷脂轉(zhuǎn)運蛋白(Phospholipid transfer protein，PLTP)對香煙誘導(dǎo)人肺泡上皮A549細(xì)胞合成白介素8(Interleukin-8，IL-8)的影響。方法：體外培養(yǎng)人肺泡上皮A549細(xì)胞株24 h，加入不同濃度的煙草提取物(Cigarette smoking extracts,CSE)共培養(yǎng)24 h；1.0% CSE與A549細(xì)胞株共培養(yǎng)6、12、24、48 h；PLTP siRNA預(yù)處理后，加入CSE共培養(yǎng)24 h。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測A549細(xì)胞增殖情況；實時定量PCR(RT-PCR)檢測PLTP和IL-8 mRNA的表達(dá)量；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PLTP的表達(dá)量;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測IL-8相對含量。結(jié)果：0.125%煙草提取物促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，0.25%、0.5%、1.0% CSE濃度對A549細(xì)胞生長無明顯影響，而2.0%、4.0% CSE濃度抑制A549細(xì)胞增殖；不同濃度的(0.25%、0.5%、1.0%)CSE作用24 h后，PLTP和IL-8 mRNA及蛋白表達(dá)量增加,并且IL-8蛋白分泌呈現(xiàn)一定時間依賴性；PLTP siRNA處理后，IL-8表達(dá)量明顯升高(P<0.001)。結(jié)論：PLTP基因缺失促進(jìn)香煙誘導(dǎo)A549細(xì)胞合成IL-8。

[關(guān)鍵詞]煙草煙霧提取物；人肺泡上皮細(xì)胞；A549;PLTP;IL-8

吸煙可以導(dǎo)致肺氣道損傷，引起肺部嚴(yán)重疾患。香煙中的固有成分及在燃燒所產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以引起肺部的炎癥反應(yīng)。調(diào)查研究顯示香煙煙霧暴露是導(dǎo)致肺損傷的一項重要危險因素[1]。研究表明，IL-8是煙霧吸入造成的肺損傷反應(yīng)中的重要介質(zhì)[2]。 Aggarwal等[3]證實,中性粒細(xì)胞激活在肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用,而IL- 8是中性粒細(xì)胞肺部浸潤的最主要的趨化因子。肺上皮細(xì)胞是炎癥趨化因子IL-8的重要來源[4]，IL-8趨化和激活炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,而這些活化的炎癥細(xì)胞又能進(jìn)一步促進(jìn)IL-8分泌。

PLTP是一類存在于包括人類和許多動物血漿中的促進(jìn)血漿脂蛋白間、脂蛋白與細(xì)胞間脂質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和交換的特殊蛋白。大量研究表明，PLTP在脂類代謝、免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)變性疾病等起著非常重要的作用，尤其是脂類代謝[5-7]。而PLTP在肺病疾病中的作用尚不十分明確，相關(guān)研究更是鳳毛麟角。文獻(xiàn)報道，正常人類和鼠肺組織是PLTP mRNA表達(dá)最為豐富的器官[8]，并且Brehm等[9]研究發(fā)現(xiàn)吸煙可以上調(diào)肺組織PLTP的表達(dá)活性，我們的前期研究也證實[10]，氧化低密度脂蛋白和煙草提取物可以刺激肺Ⅱ型上皮細(xì)胞合成PLTP,因此，本文利用肺上皮細(xì)胞特異性基因敲除的方法研究PLTP在香煙煙霧誘導(dǎo)A549細(xì)胞合成IL-8中的作用，以進(jìn)一步探討PLTP參與肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物、試劑和儀器高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo公司，SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；PLTP抗體購于美國Abcam公司，GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于Santa公司；IL-8 ELISA KIT購自博士德公司；RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix均購自TaKaRa公司，PLTP siRNA(sense：5-GAGCUGCAACUGA-CAUCUUTT-3；antisense:5-AAGAUGUCAGUUGC-AGCUCTG-3)購自吉瑪基因，其余均為國產(chǎn)試劑。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國Revco公司；高速臺式離心機(jī)，美國Sigma公司；純水儀，美國Milipore公司；M450酶標(biāo)儀，實時定量PCR儀，美國Bio-Rad公司； PAC3000型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，北京六一公司。

1.1.2細(xì)胞株來源及培養(yǎng)人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)源自重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤實驗室，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃,5%CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，所有實驗均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1煙草煙霧提取物的制備宏升牌香煙購自重慶煙草公司，每只煙含焦油11 mg，一氧化碳17 mg，尼古丁1.1 mg。根據(jù)Wirtz[11]文獻(xiàn)中提及的煙草煙霧提取物制備方法進(jìn)行操作。操作步驟如下所述：點燃一只香煙，去除濾嘴，安放在抽吸裝置上。勻速地抽吸，使煙霧通過一個裝有10 ml無血清的DMEM培養(yǎng)基的玻璃瓶，此時可見煙草煙霧通過DMEM培養(yǎng)基并產(chǎn)生大小均勻的氣泡，收集瓶中出現(xiàn)大量煙霧，且保證每支香煙燃燒約4 min。當(dāng)10支香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧通過該培養(yǎng)基后，停止抽吸。調(diào)節(jié)香煙煙霧-DMEM培養(yǎng)基混合物的pH至7.4，并用0.22 μm的過濾器除去雜質(zhì)和細(xì)菌，即為煙草煙霧提取物。使用Beckman DU 640 分光計(Fullerton,CA,USA)測定煙草煙霧提取物在320 nm處的吸光度值，約為1.36±0.12，將此時對應(yīng)的CSE濃度設(shè)為100%。實驗時，根據(jù)實驗需要將100%煙草煙霧提取物稀釋至所需濃度即可。CSE最好現(xiàn)配現(xiàn)用，盡量在制備好30 min內(nèi)使用。

1.2.2MTT法檢測CSE對A549細(xì)胞增殖的影響將約2×103/0.2 ml細(xì)胞種植在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，然后加入相應(yīng)濃度的CSE繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸盡孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次后再在每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT混勻，在37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，吸干每孔內(nèi)的上清，每孔加入DMSO 150 μl震蕩使沉淀充分溶解，酶標(biāo)儀570nm波長測定OD值。

1.2.3RT-PCR檢測IL-8 mRNA的表達(dá)取處于對數(shù)生長期的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549以2×105ml-1的密度接種于六孔板中，分別設(shè)置對照組和實驗組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實驗組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1.0%的CSE，處理24 h后收集細(xì)胞，采用Trizol法分別提取各細(xì)胞內(nèi)的總RNA，經(jīng)核酸濃度測定儀(Fullerton,CA,USA)測定RNA的濃度，并且樣品A260/280比值均介于1.8～2.0。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用兩步法將樣品逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后在PCR儀(Bio-Rad,USA)上進(jìn)行實時定量PCR測定IL-8 mRNA的表達(dá)量。

1.2.4Western blot檢測PLTP、GAPDH蛋白的表達(dá)取處于對數(shù)生長期的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549以2×105ml-1的密度接種于六孔板中，分別設(shè)置對照組和實驗組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實驗組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1.0%的CSE，處理24 h，收集上清液并4℃，3 000 r/min離心15 min后收集上清液于-80℃中保存。收集細(xì)胞用細(xì)胞裂解液于冰上同時裂解各組細(xì)胞30 min，12 000 r/min離心10 min，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。運用酶標(biāo)儀測定各組蛋白質(zhì)含量并配平，使各組蛋白終濃度一致。每個點樣孔加樣60 μg蛋白樣品液，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到0.45 μm的PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉膜上的蛋白結(jié)合位點2 h。采用兔抗人PLTP(1∶3 000),兔抗人內(nèi)參GAPDH多抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分別加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)常溫孵育2.0 h。TBST溶液漂洗,用ECL試劑發(fā)光，曝光。圖像掃描后運用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的吸光度值，對照組和實驗組目的條帶的灰度值和內(nèi)參的吸光度值比值表示蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.2.5ELISA法測定IL-8相對含量將收集的上清液稀釋三倍之后按每孔100 μl加入事先準(zhǔn)備好的ELISA試劑盒孔板中37℃孵育90 min，棄液后每孔加入生物素抗人IL-8抗體工作液100 μl 37℃反應(yīng)60 min，用PBS洗滌3次后每孔加入ABC工作液100 μl 37℃反應(yīng)30 min，再次用PBS洗滌5次后每孔按90 μl依次加入TMB顯色液，37℃避光反應(yīng)30 min后每孔加入100 μl TMB終止液。用酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值。根據(jù)所測OD做作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算IL-8蛋白表達(dá)量。

1.2.6陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA取處于對數(shù)生長期的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549以2×105ml-1的密度接種于六孔板中，分別設(shè)置陰性對照組和實驗組常規(guī)培養(yǎng)16～24 h，細(xì)胞貼壁50%左右時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；DEPC消毒的去酶EP管中加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)液及5 μl RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫孵育5 min，另取DEPC消毒的去酶EP管加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)液及60 pmol的siRNA,混勻;吸取孔板中的完全培養(yǎng)基，以PBS沖洗細(xì)胞2次，吸取PBS,每孔加入不含胎牛血清和青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，總體積為2 ml；5 min之后將RNAiMAX混合試劑和siRNA混合試劑混合，混勻，室溫靜置20 min后按照分組加入孔板中；37℃孵育6 h后，吸取培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基孵育18～24 h后，再將A549細(xì)胞設(shè)置為NC siRNA處理組、CSE+NC siRNA處理組、siPLTP處理組、CSE+siPLTP處理組處理24 h之后收取上清液用ELISA法測定IL-8相對含量，提取各組細(xì)胞RNA以及總蛋白，分別用RT-PCR測定PLTP、IL-8 mRNA的表達(dá)情況以及用Western blot檢測PLTP蛋白的表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1煙草煙霧提取物對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549合成IL-8的影響如圖1A所示，經(jīng)不同濃度(0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)的煙草煙霧提取物作用于A549細(xì)胞，采用MTT法，測煙草提取物對A549細(xì)胞增殖情況的影響，我們發(fā)現(xiàn)0.125%濃度的煙草提取物可以促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，0.25%、0.5%、1.0%濃度對細(xì)胞增殖無明顯影響，而2.0%和4.0%濃度的煙草提取物可以明顯抑制A549細(xì)胞增殖并且促進(jìn)其死亡；如圖1B～D所示，經(jīng)不同濃度(0.25%、0.5%、1.0%)和不同時間(6、12、24、48 h)的煙草煙霧提取物作用于A549細(xì)胞，IL-8表達(dá)隨著煙草濃度的增加而增加，并且在24 h分泌達(dá)到明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，煙草煙霧提取物能夠刺激A549細(xì)胞合成和分泌IL-8，并且呈現(xiàn)濃度依賴性和一定的時間依賴性。

2.2煙草煙霧提取物對人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549合成PLTP的影響如圖2所示，經(jīng)不同濃度的煙草煙霧提取物作用于A549細(xì)胞24 h，PLTP的表達(dá)隨著煙草濃度升高而增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，煙草煙霧提取物能夠刺激A549細(xì)胞合成PLTP,而PLTP與IL-8是否存在內(nèi)在聯(lián)系，尚需論證。

2.3PLTP轉(zhuǎn)染效率以及在正常情況下和煙草煙霧刺激下其對IL-8 mRNA表達(dá)的影響如圖3所示，PLTP siRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定48 h ，PLTP siRNA的基因沉默率達(dá)到70%，并且觀察到PLTP基因沉默之后，IL-8 mRNA的表達(dá)反而升高，并且PLTP siRNA沉默之后促進(jìn)煙草提取物刺激A549細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)。

2.4PLTP基因沉默對煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549 PLTP以及IL-8蛋白表達(dá)的影響如圖4所示，1%的煙草提取物濃度作為工作濃度，PLTP siRNA預(yù)處理后，加入煙草提取物共培養(yǎng)24 h ，PLTP基因沉默之后可以促進(jìn)基礎(chǔ)以及煙草提取物刺激后IL-8蛋白的釋放。

圖1　煙草提取物對A549細(xì)胞釋放IL-8的影響Fig.1　Effects of CSE on expression of IL-8 in A549 cellsNote: A,B,D.Different concentrations of CSE group vs control group,*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001；C.6 h，12 h，24 h and 48 h groups vs 0 h group,**.P<0.01;***.P<0.001.

圖2　WB檢測不同濃度煙草提取物對PLTP蛋白水平影響Fig.2　Protein expression of PLTP detected by WesternblotNote: Different concentrations of CSE groups vs control group，*.P<0.05；**.P<0.01.

圖3　RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率Fig.3　Infection efficiency detected by RT-PCRNote: A.Infection efficiency of A549 cells by RT-PCR;B.PLTP mRNA and IL-8 mRNA expression detected by PT-PCR.PLTP siRNA group vs NC siRNA group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;PLTP siRNA+CSE group vs NC siRNA+CSE group,###.P<0.001.

圖4　PLTP及IL-8蛋白表達(dá)情況Fig.4　Protein expression of PLTP and IL-8 in each groupsNote: A.Protein expression of PLTP detected by Western blot;B.Protein expression of IL-8 detected by ELISA.PLTP siRNA group vs NC siRNA group,**.P<0.01;PLTP siRNA+CSE group vs NC siRNA+CSE group,###.P<0.001.

3討論

煙草煙霧中含有大量自由基(ROS)和有毒物質(zhì)，吸入人體可導(dǎo)致細(xì)胞癌變、氣道損傷以及肺部炎癥。有研究報道[12，13]，不管是小鼠吸煙模型還是細(xì)胞離體實驗中，IL-8表達(dá)升高幅度均比其他炎癥因子高。并且IL-8在煙草煙霧導(dǎo)致的肺損傷中起著重要作用，它可以趨化和激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致其在肺部的浸潤。Modelska等[14]均研究發(fā)現(xiàn),抗IL-8預(yù)處理可阻斷中性粒細(xì)胞的肺部浸潤,顯著降低鹽酸、內(nèi)毒素等對血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞的損傷。

PLTP是一類存在于包括人類和許多動物血漿中的促進(jìn)血漿脂蛋白間、脂蛋白與細(xì)胞間脂質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和交換的特殊蛋白。其在生命活動中起著重要作用，其水平及活性與多種炎癥性疾病相關(guān)，比如動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)炎癥等[7,15,16]，但是至今尚未有研究PLTP在煙草煙霧引起的肺損傷中的作用報道。我們研究的目的主要是探索吸煙引起的肺損傷與PLTP的關(guān)系?？紤]到香煙成分復(fù)雜，而煙草對肺部的影響并非單一物質(zhì)而是成千上萬的有毒物質(zhì)，所以我們利用香煙而不是某種單體成分來研究吸煙對炎癥反應(yīng)的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在離體細(xì)胞實驗中，PLTP以及IL-8的表達(dá)量具有煙草濃度依賴性，隨著煙草濃度的增加，合成的PLTP和IL-8的量也在不斷增加(如圖1B、D,圖2所示)。而通過PLTP基因沉默發(fā)現(xiàn)IL-8不管是在基礎(chǔ)水平還是在煙草煙霧誘導(dǎo)情況下均顯著升高(如圖3、圖4所示),表明PLTP在一定程度下可以抑制IL-8的合成。PLTP在煙草煙霧刺激下細(xì)胞內(nèi)合成增加，這與Brehm等[9]的研究結(jié)果一致。但是我們的研究結(jié)果表明PLTP具有抗炎作用，那么煙草煙霧誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)IL-8明顯升高，PLTP也呈現(xiàn)出增高趨勢,這是否背道而馳？有研究報道[17]，在嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥小鼠模型中，與野生型小鼠相比，PLTP-/-小鼠的血漿以及組織中炎癥因子水平更高，將其分離得到的脾細(xì)胞暴露于脂多糖(LPS)中，其炎癥反應(yīng)比野生型的更為劇烈，并且脾細(xì)胞死亡率也顯著升高。而在臨床研究中表明，病人細(xì)菌感染以及發(fā)生全身性炎癥時PLTP活性升高，這也許是機(jī)體自我保護(hù)的重要代償機(jī)制[18,19]；而Brehm等[9]的研究結(jié)果表明，PLTP在肺泡灌洗液中的活性下降。上述兩個方面的原因可能是細(xì)胞內(nèi)合成PLTP增加的原因。然而，在Schlitt等[20]的研究卻發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化小鼠模型中，PLTP-/-小鼠通過下調(diào)白介素6(IL-6)達(dá)到抗炎作用，這與Gautier等[17]的研究結(jié)果以及我們的實驗結(jié)果相反，可能原因有二，其一是模型的不同，再者就是所測的炎癥因子不同，提示PLTP在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)表達(dá)中作用機(jī)制復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，我們證實PLTP基因沉默后可以使香煙誘導(dǎo)A549細(xì)胞合成和釋炎癥因子IL-8增加，說明PLTP基因具有一定的抗炎作用。通過此實驗，可以為研究煙草煙霧所致的肺部急性炎癥疾病致病機(jī)制提供思路和參考。

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[收稿2015-07-15修回2015-07-23]

(編輯倪鵬)

Effect of PLTP on CSE-induced IL-8 production in A549 cells

YUXiu-Ying,CHENYa-Juan,WUFeng-Ping,ZOULin-Lin,CHENYu-Han,LIYou-Lun.

DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospital,Chongqing400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of PLTP gene on CSE-induced IL-8 production in human alveolar Type Ⅱ cells(Adenocarcinomic human alveolar epithelial cells，A549).Methods: The different concentrations of CSE co-cultured with human alveolar epithelial cell line(A549) for 24 hours.MTT assay was performed to study the effect of CSE on human alveolar epithelial cell line(A549) growth.Expression levels of PLTP mRNA and IL-8 mRNA were examined by RT-PCR,protein of PLTP were examined by Western blot,and protein of IL-8 was examined by ELISA.Results: MTT assay showed that the proliferation of A549 cell line were stimulated by the 0.125% CSE,while the proliferation of A549 cell tends to decrease at high concentrations of CSE(2.0% CSE and 4.0% CSE),and in this middle concentrations of CSE(0.25% CSE ,0.5% CSE and 1.0% CSE),the proliferation of A549 cell was not significantly affected.Our studys suggested that PLTP and IL-8 release were induced by CSE in a concentration-dependent and time-dependent manner,and expression levels of IL-8 obviously increased after silence PLTP gene.Conclusion: PLTP siRNA can increased CSE-induced IL-8 production in human alveolar epithelial cells(A549).

[Key words]Cigarette Smoke Extract;Human alveolar Type Ⅱ cells;A549;PLTP;IL-8

中圖分類號R563.19

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0318-05

作者簡介：余秀英(1989年-)，女，在讀碩士,主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究，E-mail：405426832@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：黎友倫(1965年-)，男，博士，教授，主要從事肺結(jié)核、肺癌等方面的研究，E-mail:liyoulun83@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.005

①本文為國家自然科學(xué)基金青年基金(81200009)、重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥研究課題(ZY20132165)和國家臨床重點?？茖ｍ椯Y助(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號)。