張　穎　白　力　張文蘭　尹學(xué)紅　張　偉　龐春艷　王永福

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，包頭014040)

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

去乙酰化酶抑制劑VPA對(duì)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程的影響①

張穎白力張文蘭尹學(xué)紅張偉龐春艷王永福

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，包頭014040)

[摘要]目的：本研究通過(guò)分析去乙酰化酶抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中組蛋白修飾的影響，以及對(duì)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程的影響，分析去乙?；敢种苿┦欠窨梢酝ㄟ^(guò)改變巨噬細(xì)胞的組蛋白修飾,進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞極化的過(guò)程，旨在為治療自身免疫性疾病提供新的思路。方法：利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)J774.1巨噬細(xì)胞24 h，白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)J774.1巨噬細(xì)胞24 h，并在誘導(dǎo)過(guò)程中加入2 mmol/L丙戊酸(Valproic acid，VPA)，收集巨噬細(xì)胞，實(shí)時(shí)免疫熒光定量PCR和ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化的特異性標(biāo)記基因的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)組蛋白修飾情況。結(jié)果：J774.1細(xì)胞經(jīng)LPS和IFN-γ誘導(dǎo)24 h極化為M1型巨噬細(xì)胞；經(jīng)IL-4刺激24 h極化為M2型巨噬細(xì)胞，VPA處理后的M1型巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9的乙?；潭壬?，標(biāo)記基因白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CC趨化因子配體2[Chemokine(C-C motif) ligand 2，CCL2]的表達(dá)量降低，CD86的表達(dá)量升高；VPA處理后的M2型巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9的乙酰化程度也升高，標(biāo)記基因精氨酸酶(Arginase-1,Arg-1)、Fizz-1(Found in inflammatory zone-1,Fizz-1)、甘露糖受體(CD206)、Ym1的表達(dá)量升高。結(jié)論：巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和組蛋白的修飾具有一定的相關(guān)性，VPA在M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)體系中可以促使M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但是在M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)體系中，卻抑制了M1型巨噬細(xì)胞的特異性基因的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]組蛋白修飾；巨噬細(xì)胞極化；去乙?；敢种苿?；M1型巨噬細(xì)胞；M2型巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞幾乎存在于機(jī)體的各個(gè)器官與組織，在免疫應(yīng)答、宿主防御、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮極其重要的作用，并且作為主要的抗原遞呈細(xì)胞在啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，分布組織、器官的不同或局部微環(huán)境的改變，甚至體外刺激的差異，都會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答，從而獲得不同的功能表型[1,2]。根據(jù)巨噬細(xì)胞活化后的不同表型，巨噬細(xì)胞被分為M1 型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞又稱經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophages，CA-Mφ)，M2型巨噬細(xì)胞又稱替代活化巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophages，AA-Mφ)[3]。目前常采用IFN-γ或是LPS、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)刺激誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有IL-12hi、IL-23hi、IL-10low的表型，同時(shí)分泌一系列的可以誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)的效應(yīng)分子，例如活性氧化物(Reactive oxygen ，ROX)以及炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α和IL-6[4-8]。與M1型巨噬細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的是由IL-4和IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2型替代活化巨噬細(xì)胞[9-11]。M2型巨噬細(xì)胞具有IL-12low、 IL-23low的表型，并且高表達(dá)清道夫受體和甘露糖類型的受體[12]。M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)組織修復(fù)和重建的能力，并且具有改善Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)誘導(dǎo)的自身免疫性疾病的能力[1]。已公認(rèn)的M1型特異性表達(dá)的基因?yàn)門(mén)NF-α、IL-6、iNOS、CCL-2、CD86，M2型特異性表達(dá)基因?yàn)镃D206、Arginase、Fizz-1、Ym1[13]。

目前已有的研究表明，去乙?；敢种苿┯锌寡椎奶匦訹1]。VPA是Ⅰ類去乙?；敢种苿?，它在組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄、核小體重塑中起著作用[14]。VPA首先被應(yīng)用于癌癥治療的領(lǐng)域，研究證明可以通過(guò)抑制組蛋白去乙?；?Histone deacetylase,HDAC)的作用，使核小體組蛋白乙?；?，改變HDAC參與的基因表達(dá)。

本研究在小鼠巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中加入去乙?；敢种苿￢PA，分析VPA是否通過(guò)改變巨噬細(xì)胞的組蛋白修飾，進(jìn)而使巨噬細(xì)胞極化方向發(fā)生改變，最終改變巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌。

1材料與方法

1.1材料CD86/B7-2 抗體、Mannose Receptor/CD206 Antibody、Rat IgG 2a Isotype Control、Goat Anti-rat IgG/PE(ebioscience，USA)；Rabbit IgG Isotype Control Alexa Fluor? 488 Conjugate(Cell signal,USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR037A、Trizol、熒光定量試劑盒DR041A(TaKaRa,China);Recombinant Mouse IL-4/Interleukin-4、Recombinant Mouse Interferon-γ(Sino Biological,USA)；LPS(Sigma，USA)；TNF-α、IL-6、CD206細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(新啟迪,China)；Acetyl-Histone H3K9抗體(Invitrogen,USA)；VPA、StemoleculeTMValproic Acid(STEMGENT,USA)。

儀器：熒光定量PCR儀(BIOER,LineGene 9640，China),流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoTMⅡ，USA)，酶標(biāo)儀(Rayto，RT-6500，China)。

1.2方法

1.2.1M1型和M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)方法取J774.1巨噬細(xì)胞用DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)體系培養(yǎng)細(xì)胞至90%匯合度后用胰酶消化細(xì)胞3 min，1 600 r/min離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)。用DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)體系將J774.1巨噬細(xì)胞稀釋成1×105ml-1細(xì)胞濃度并接種于6.0 cm培養(yǎng)皿中(作為對(duì)照組C組)；用100 ng/ml LPS+30 ng/ml IFN-γ M1型誘導(dǎo)培養(yǎng)體系將J774.1巨噬細(xì)胞稀釋成1×105ml-1細(xì)胞濃度并接種于6.0 cm培養(yǎng)皿中(作為M1型巨噬細(xì)胞組)；用100 ng/ml IL-4 M2型誘導(dǎo)培養(yǎng)體系將J774.1巨噬細(xì)胞稀釋成1×105ml-1細(xì)胞濃度并接種于6.0 cm培養(yǎng)皿中(作為M2型巨噬細(xì)胞組)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2MTT法檢測(cè)VPA處理巨噬細(xì)胞的最適濃度①接種細(xì)胞：以每孔1 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。②培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞24 h。③呈色：培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，然后每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。④比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。計(jì)算IC50，計(jì)算方法：lgIC50=Xm-I[(P-(3-Pm-Pn)/4]，其中Xm:lg 最大劑量，I:lg(最大劑量/相臨劑量)，P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和，Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率，Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率。

1.2.3去乙?；敢种苿?VPA)處理極化巨噬細(xì)胞C組、M1組、M2組按前面所述方法培養(yǎng)，用M1型誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加2 mmol/L濃度VPA，將J774.1巨噬細(xì)胞稀釋成1×105ml-1細(xì)胞濃度并接種于6.0 cm培養(yǎng)皿中(作為M1+VPA組)；用M2型誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加2 mmol/L濃度VPA，將J774.1巨噬細(xì)胞稀釋成1×105ml-1細(xì)胞濃度并接種于6.0 cm培養(yǎng)皿中(作為M2+VPA組)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞。

1.2.4流式鑒定J774.1巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記物收集VPA處理極化的巨噬細(xì)胞，各組分別經(jīng)過(guò)4%多氯甲醛、體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇(提前4℃預(yù)冷)處理后，分別加入300 μl一抗(CD86、CD206)，輕輕混勻，室溫避光孵育1 h；5 min，1 600 r/min離心，收集細(xì)胞，再分別加入300 μl二抗，室溫避光孵育30 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞特異性基因的表達(dá)利用RNAiso Plus方法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，4 ℃保存，備用。引物由上海生工合成，具體引物序列見(jiàn)表1。

將配置好的PCR反應(yīng)液放入PCR儀中，設(shè)置程序和條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40循環(huán)；95℃反應(yīng)15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s 進(jìn)行擴(kuò)增，qRT-PCR 由熒光定量 PCR儀自動(dòng)采集目的基因與內(nèi)參基因的Ct值。各個(gè)基因的基因表達(dá)量根據(jù)公式計(jì)算。實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組目的基因相對(duì)表達(dá)量△Ct=Ct(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組目的基因)-CT(β-actin)；△△CT=實(shí)驗(yàn)組△CT-對(duì)照組△CT；目的基因?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組間的相對(duì)表達(dá)量(即實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù))=2-△△CT。

表1實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

Tab.1Primer sequences for real-time PCR analysis

PrimernamePrimersequenceIL-6Forward:5'-TGATGGATGCTACCAAACTGG-3'Reverse:5'-TGGTCTTGGTCCTTAGCCACT-3'TNF-αForward:5'-TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3'Reverse:5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3'CCL2Forward:5'-AAGAGGATCACCAGCAGCAG-3'Reverse:5'-GGTCAGCACAGACCTCTCTCTT-3'CD86Forward:5'-ACGGACTTGAACAACCAGAC-3'Reverse:5'-TGCAGTCCCATTGAAATAAG-3'Arg-1Forward:5'-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3'Reverse:5'-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3'CD206Forward:5'-GGAAACGGGAGAACCATCAC-3'Reverse:5'-GGCGAGCATCAAGAGTAAAG-3'Fizz-1Forward:5'-TGATGGTCCCAGTGAATAC-3'Reverse:5'-GGCCCATCTGTTCATAGTC-3'Ym1Forward:5'-AGCAATCCTGAAGACACC-3'Reverse:5'-CCCTTCTATTGGCCTGTC-3'β-actinForward:5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3'Reverse:5'-AGCCTGGATGGCTACGTACA-3'

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞乙?；兓占鹘M已用極化因子和VPA處理24 h后的巨噬細(xì)胞，每組細(xì)胞分別用多聚甲醛、 90%的甲醇處理，用1 ml PBS+5/1 000牛血清白蛋白(BSA)洗滌；對(duì)照組中加入200 μl PBS+5/1 000 BSA，同型對(duì)照組中加入200 μl PBS+5/1 000 BSA+Rabbit IgG Isotype Control(AlexalR)488,其余各組中加入200 μl一抗H3K9 Ace，孵育后收集細(xì)胞，同型對(duì)照組中加入150 μl PBS+5/1 000 BSA，其余各組中加入150 μl二抗[1 ml PBS+PBS+5/1 000 BSA +Anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor(R)488]，孵育30 min；將各組細(xì)胞分別加入到各檢測(cè)管中，上機(jī)。

1.2.7免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞乙?；兓PA處理的極化巨噬細(xì)胞，用PBS洗一次，再用100%甲醇浸沒(méi)細(xì)胞，在甲醇中-20℃孵育10 min，然后用PBS沖洗5 min；將樣品在封閉液中封閉60 min；加入稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜；用PBS沖洗3次，將樣品與用抗體稀釋液稀釋的熒光標(biāo)記二抗在室溫下避光孵育1～2 h；蓋上玻片；立即在顯微鏡下用相應(yīng)波長(zhǎng)激發(fā)光觀察樣品。

1.2.8ELISA法測(cè)定巨噬細(xì)胞上清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、CD206的表達(dá)情況收集VPA處理極化的巨噬細(xì)胞上清液，分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中(100 μl/孔),封反應(yīng)孔，加入生物素小鼠抗體工作液(100 μl/孔)，之后除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100 μl/孔)，再加入TMB顯色工作液(100 μl/孔)，最后加入終止液(100 μl/孔)，混勻后即刻測(cè)量OD(450nm)值(10 min內(nèi))。

2結(jié)果

2.1MTT法測(cè)定VPA對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響用IC50計(jì)算公式計(jì)算IC50得出為2.961，IC50值的1/3～1/2為VPA的最適濃度，可以得出2 mmol/L濃度的VPA為合適的處理濃度(見(jiàn)表2)。

2.2不同刺激條件下J774.1細(xì)胞的形態(tài)從圖1中可以看出，巨噬細(xì)胞極化成M1型巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞梭形，多觸角形態(tài)，極化成M2型巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞圓潤(rùn)，呈聚團(tuán)現(xiàn)象，VPA處理的M1型巨噬細(xì)胞體積明顯變大，變長(zhǎng)，呈條索樣形態(tài)，VPA處理的M2型巨噬細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象消失，細(xì)胞體積變大，部分細(xì)胞出現(xiàn)觸角，呈星形，單純VPA處理的巨噬細(xì)胞體積變大，成多觸角毛刺樣形態(tài)。

2.3流式鑒定J774.1巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86/CD206CD86流式鑒定結(jié)果顯示：C、IS、M2、M2+VPA組CD86為陰性，而M1和M1+VPA組CD86為陽(yáng)性，且M1+VPA組陽(yáng)性率高于M1組(見(jiàn)圖2)。

CD206流式鑒定結(jié)果顯示：C、IS、M1組CD206為陰性，而M1+VPA、M2、M2+VPA組CD206為陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)。

VPA(mmol/L)ODvalues00.2672±0.019410.2737±0.027120.2517±0.025230.2399±0.02673)40.2320±0.02692)50.2486±0.02513)60.2264±0.02471)70.2232±0.02283)80.2118±0.02323)IC502.961

Note：Compared with the control group，1)P<0.05，2)P<0.010，3)P<0.005.

圖1　不同刺激條件下J774.1細(xì)胞的形態(tài)Fig.1　Morphology of J774.1 cells under different stimulation conditionsNote: A.J774.1 cells;B.M1 macrophages;C.M1 macrophages with VPA treated;D.M2 macrophages;E.M2 macrophages with VPA treated;F.J774.1 cells with VPA treated.

2.4不同刺激條件下J774.1細(xì)胞相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量LPS(100 ng/ml)+IFN-γ(30 ng/ml)+VPA(2 mmol/L)刺激增殖狀態(tài)的J774.1細(xì)胞24 h，或者IL-4(100 ng/ml)+VPA(2 mmol/L)刺激增殖狀態(tài)的J774.1細(xì)胞24 h，分別檢測(cè)相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示：VPA處理后的M1型巨噬細(xì)胞中，IL-6(P=0.000 2)、iNOS(P=0.001 3)、CCL-2(P=0.000 7)的表達(dá)量明顯減少,CD86(P=0.016 8)、Arg-1(P<0.005)、CD206(P<0.005)、Ym1(P=0.000 3)的表達(dá)明顯升高;VPA處理后的M2型巨噬細(xì)胞中，IL-6(P=0.000 6)、iNOS(P=0.023 5)、CCL-2(P=0.008 6)的表達(dá)量明顯減少，Arg-1(P<0.005)、Fizz-1(P<0.005)、CD206(P=0.000 4)、Ym1(P=0.042 8)的表達(dá)量明顯增加(見(jiàn)圖4)。

圖2　CD86流式鑒定結(jié)果Fig.2　Flow identification results of CD86Note: A.Control group;B.Same type control group;C.M1 macrophages group;D.M1 macrophages +VPA group;E.M2 macrophages group;F.M2 macrophages +VPA group.

圖3　CD206流式鑒定結(jié)果Fig.3　Flow identification results of CD206Note: A.Control group;B.Same type control group;C.M1 macrophages group;D.M1 macrophages +VPA group;E.M2 macrophages group;F.M2 macrophages +VPA group.

2.5不同刺激條件下J774.1細(xì)胞上清液細(xì)胞因子水平測(cè)定VPA處理后的M1型巨噬細(xì)胞中，IL-6(P=0.000 2)、TNF-α(P=0.012 0)的表達(dá)量明顯減少，CD206(P=0.036 1)的表達(dá)量明顯增加；VPA處理后的M1型巨噬細(xì)胞中,IL-6(P=0.010 1)、TNF-α(P=0.014 4)的表達(dá)量明顯減少，CD206(P<0.005)的表達(dá)量明顯增加(如圖5)。

圖4　RT-PCR 法結(jié)果顯示VPA處理J774.1巨噬細(xì)胞后IL-6、iNOS、CCL-2、CD86、Arg-1、CD206、Fizz-1、Ym1 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化Fig.4　RT-PCR shows relative expression of IL-6,iNOS,CCL-2,CD86,Arg-1,CD206,Fizz-1,Ym1 mRNAs in Polarized J774.1 cells treated with VPA for 24 hNote: The levels of cytokines are expressed relative to the levels of β-actin(0.01).

2.6VPA處理極化的巨噬細(xì)胞表觀遺傳學(xué)方面的改變免疫熒光方法和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)VPA處理極化巨噬細(xì)胞后組蛋白H3K9乙?；淖兓?，結(jié)果顯示VPA使巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9乙?；矫黠@增加(P=0.048 4)(見(jiàn)圖6)。A為免疫熒光方法檢測(cè)VPA對(duì)M1型細(xì)胞組蛋白H3K9乙酰化的影響，B為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞VPA對(duì)M1型細(xì)胞組蛋白H3K9乙?；挠绊?，C為免疫熒光方法檢測(cè)VPA對(duì)M2型細(xì)胞組蛋白H3K9乙?；挠绊懀珼為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞VPA對(duì)M2型細(xì)胞組蛋白H3K9乙?；挠绊?。

圖5　ELISA檢測(cè)VPA處理后巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、CD206表達(dá)量變化Fig.5　ELISA assay detects expression of IL-6,TNF-α and CD206 in supernatant of macrophages treated by VPA

圖6　VPA對(duì)巨噬細(xì)胞表觀遺傳學(xué)影響Fig.6　Effect of VPA on epigenetics of macrophage

3討論

眾所周知，巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象在自身免疫性性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中廣泛存在，其極化調(diào)節(jié)主要是通過(guò)一些核內(nèi)的信號(hào)蛋白發(fā)揮作用[15]。巨噬細(xì)胞極化的平衡失調(diào)能反映局部組織的微環(huán)境炎癥狀態(tài)，具有促炎特性的 M1 型巨噬細(xì)胞和具有抗炎特性的M2型巨噬細(xì)胞間的相互轉(zhuǎn)化，可以使巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境獲得不同的功能表型，這一特點(diǎn)使它在機(jī)體不同生理、病理?xiàng)l件下發(fā)揮不同的功能，在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。

在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，由于受到不同的細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞因子的調(diào)控和影響，M1/M2亞型的平衡一直處于動(dòng)態(tài)變化中，向任何一方的傾斜都決定了炎癥的最終轉(zhuǎn)歸，而M2型巨噬細(xì)胞的抗炎作用在多種自身免疫性疾病中都有治療作用。

去乙?；敢种苿￢PA在調(diào)控獲得性免疫反應(yīng)中起著多方面的作用，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路使得抗原表達(dá)量增加，輔助T細(xì)胞(Th)極化，淋巴細(xì)胞成熟,并且可以調(diào)控共刺激分子表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]，這可以解釋巨噬細(xì)胞在自身免疫性疾病中表現(xiàn)出來(lái)的巨大的可塑性。即VPA能夠緩解由Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)引起的自身免疫性疾病的癥狀[1]。雖然去乙酰化酶抑制劑VPA在治療自身免疫性疾病等方面的作用已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)同，但是在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中組蛋白修飾的機(jī)制還存在著很多未知的地方。

有研究表明VPA能夠通過(guò)組蛋白修飾抑制核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear transcription factor ，NF-κB)通道的活性，減少炎性因子的產(chǎn)生[3]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)去乙酰化酶抑制劑VPA和極化過(guò)程中的J774.1細(xì)胞共培養(yǎng)后，可以抑制炎性因子IL-6、iNOS、CCL-2的表達(dá)，促進(jìn)CD86的表達(dá)；促進(jìn)抑炎性因子Arginase、Fizz-1、CD206、Ym1的表達(dá)，說(shuō)明去乙?；敢种苿￢PA能夠使巨噬細(xì)胞的表型發(fā)生改變，從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。而本實(shí)驗(yàn)中也觀測(cè)到了VPA使M1型巨噬細(xì)胞的組蛋白H3K9的乙酰化程度升高。研究表明去乙?；敢种苿┦菇M蛋白H3K9的乙酰化程度升高[17]，進(jìn)而提高干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor，IRF)介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，所以VPA可能通過(guò)提高IRF介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，導(dǎo)致NF-κB通道活性降低，引起干擾素α(Interfenron-α，IFN-α)、干擾素β(Interferon-β，IFN-β)的表達(dá)量升高，從而使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)信號(hào)通路活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因IL-6、iNOS、CCL-2表達(dá)量降低，與此同時(shí)，組蛋白H3K9的乙?；潭壬咭院螅筍TAT6、 IRF4和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)信號(hào)通路活性減弱，進(jìn)而使M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的抗炎性基因Arginase、Fizz-1、CD206、Ym1表達(dá)量增多。

另一方面，研究表明組蛋白H3K9乙?；c活化基因相關(guān)，屬促進(jìn)性修飾，參與基因的轉(zhuǎn)錄激活，在巨噬細(xì)胞可塑性中起著重要作用。組蛋白修飾和核小體重塑與 T 細(xì)胞的基因表達(dá)密切相關(guān)，其轉(zhuǎn)錄后修飾常通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的可接近性，從而促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[5]。通過(guò)組蛋白修飾引起的染色質(zhì)重塑，是特異性免疫反應(yīng)中重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制[18]。

與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去乙?；敢种苿￢PA作用后的M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因CD86的表達(dá)量反而升高。去乙酰化酶依賴性巨噬細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)可能與組蛋白去乙?；?1抗體有關(guān)，因?yàn)橛醒芯恳呀?jīng)發(fā)現(xiàn)這個(gè)去乙酰化酶的異位表達(dá)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中CD40和CD86的表達(dá)，但具體機(jī)制還不清楚[16]。

總而言之，去乙酰化酶抑制劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種重要途徑來(lái)有效規(guī)劃巨噬細(xì)胞平衡的不同方面[15]。這表明組蛋白H3K9的修飾和巨噬細(xì)胞的極化過(guò)程有著密切的聯(lián)系，因此我們可以通過(guò)控制巨噬細(xì)胞的組蛋白修飾，對(duì)巨噬細(xì)胞極化的某些關(guān)鍵步驟加以合理干預(yù)，扭轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞已偏移的極化失衡狀態(tài)，即使其從M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化，這將有可能從一些新的思路來(lái)治療多種免疫相關(guān)疾病。

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[收稿2015-07-25]

(編輯張曉舟)

Effect of deacetylase inhibitor VPA on polarization of macrophages

ZHANGYing,BAILi,ZHANGWen-Lan,YINXue-Hong,ZHANGWei,PANGChun-Yan,WANGYong-Fu.

TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology,Baotou014040,China

[Abstract]Objective:By analyzing the effect of deacetylase inhibitors on macrophage polarization process of histone modification,and the influence of the process of macrophage polarization,analysis deacetylase inhibitors whether have the effect on the activity of the macrophage polarization by altered histone modification of macrophages,in order to provide a new perspective for the treatment of autoimmune diseases.Methods: Using lipopolysaccharide(LPS) and interferon-γ(IFN-γ) to stimulate J774.1 cells for 24 h,and interleukin-4(IL-4)to stimulate J774.1 cells for 24 h.And 2 mmol/L valproic acid(VPA) was added in the induction process.Collecting J774.1 cells,fluorescent quantitation PCR assay and ELISA assay was used for the detection of specific markers of gene expression in macrophage polarization,flow cytometry and immunofluorescence assay for the detection of histone modifications.Results: J774.1 cells were polarized into M1 macrophages which were stimulated by LPS and IFN-γ for 24 h;and also J774.1 cells were polarized into M2 macrophages which were stimulated by IL-4 for 24 h.The degree of acetylation of H3K9 for M1 phenotype was increased after VPA treatment,the expression of interleukin-6(IL-6),inducible nitric oxide synthase(iNOS),and chemotactic factor(CCL-2)was decreased,and the expression of CD86 was increased.The degree of acetylation of H3K9 for M1 phenotype was also increased after VPA treatment，and also the expression of Arginase,Fizz-1,mannose receptor(CD206) and Ym1 were increased.Conclusion: The polarization state of the macrophages and histone modification had a certain relevance.VPA could induce the transformation of M1 phenotype to M2 phenotype in the induction system of the M1 macrophages,however,the expression of specific genes in M1 phenotype was inhibited in the induction system of the M2 macrophages.

[Key words]Histone modification;Macrophage polarization；Deacetylase inhibitor；M1 macrophages;M2 macrophages

中圖分類號(hào)R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0307-07

作者簡(jiǎn)介：張穎(1988年-)，女，在讀碩士，主要從事組蛋白修飾和細(xì)胞之間關(guān)系的研究，E-mail：1037842189@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：王永福(1968年-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性疾病的研究，E-mail：wyf5168@hotmail.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.003

①本文受2014年度國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(No.81450040)和2015年度國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(No.81360464)資助。