■李越

（包頭市環(huán)境監(jiān)測站內(nèi)蒙古包頭014060）

生物監(jiān)測方法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

■李越

（包頭市環(huán)境監(jiān)測站內(nèi)蒙古包頭014060）

總結(jié)了近年來現(xiàn)代生物技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用情況，著重介紹了現(xiàn)代生物技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測與評價(jià)、環(huán)境工程領(lǐng)域的新型實(shí)用成果，并就該技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢進(jìn)行了分析。

現(xiàn)代生物技術(shù) 環(huán)境監(jiān)測 生物傳感器 PCR

現(xiàn)代生物技術(shù)是指以 DAN 技術(shù)為先導(dǎo)，包括微生物工程細(xì)胞工程、酶工程、基因工程、蛋白質(zhì)工程和生物修復(fù)技術(shù)在內(nèi)的一系列生物高新技術(shù)的統(tǒng)稱?，F(xiàn)代生物技術(shù)與其他高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)一樣具有效益高、開發(fā)周期短的特點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)過了基礎(chǔ)理論研究發(fā)展階段，自 70 年代末以來，已開始了大規(guī)模工程應(yīng)用的實(shí)用階段?，F(xiàn)代生物技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、高新技術(shù)農(nóng)業(yè)、藥品和發(fā)酵工業(yè)，而且在日益嚴(yán)重的環(huán)境污染的監(jiān)測評價(jià)與防治等方面發(fā)揮著不可替代的作用?？梢灶A(yù)言，在今后的一段時(shí)間內(nèi)，現(xiàn)代生物技術(shù)將成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)開發(fā)和應(yīng)用的技術(shù)手段。

1 生物傳感器

隨著科技的發(fā)展，以及各學(xué)科的融合交叉，以 DNA 重組技術(shù)為標(biāo)志的現(xiàn)代生物技術(shù)正被利用到環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，構(gòu)成了現(xiàn)代生物監(jiān)測技術(shù)。在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，現(xiàn)在廣泛使用的生物監(jiān)測技術(shù)主要是將生物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為電信號的生物傳感器。

生物傳感器是以固定化細(xì)胞核、固定化酶技術(shù)為基礎(chǔ)，以生物學(xué)元件作為功能性識別元件，識別和感知目的被測物并將其按一定規(guī)律轉(zhuǎn)化為可識別信號的器件或裝置，其工作原理是：生物組分與待測對象發(fā)生相互作用，通過電子組分將待測對象檢出并轉(zhuǎn)化為可測量的電子信號。

生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測中起著越來越重要的作用。固定化生物層與目標(biāo)污染物之間的專一性作用是設(shè)計(jì)生物傳感器的理論基礎(chǔ)，基于生物催化（酶、微生物等）和免疫原理的生物傳感器已在環(huán)境領(lǐng)域中獲得了廣泛應(yīng)用。然而利用核酸探針為敏感元件的傳感器在環(huán)境監(jiān)測中開發(fā)應(yīng)用尚處于起步階段。分子生物學(xué)與生物技術(shù)的進(jìn)展為研究DNA 生物傳感器提供了可能。與酶和抗體不同，核酸識別層十分穩(wěn)定，并且易于合成或再生以供重復(fù)使用。DNA 生物傳感器為生物傳感器家族中添加了新的成員，DNA 傳感器的實(shí)現(xiàn)需要正確地選擇核酸探針及其固定化和 DNA 識別信號的有效轉(zhuǎn)換與檢測。毫無疑問，隨著該項(xiàng)技術(shù)的不斷深入研究和日臻成熟，DNA 生物傳感器將成為環(huán)境污染監(jiān)測領(lǐng)域中的一個(gè)重要手段。

2 PCR技術(shù)

PCR 技術(shù)模擬 DNA 的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的引物，該原理主要包括 3 個(gè)基本反應(yīng)過程：變性———退火———延伸。變性主要是指雙鏈 DNA 的變性，即雙鏈 DNA 經(jīng)加熱至93℃左右，其熱穩(wěn)定性降低，配對堿基之間的氫鍵斷裂，使雙鏈 DNA成為單鏈，以便與引物結(jié)合。退火是指單鏈 DNA 在溫度降低時(shí)與引物的復(fù)性（稱為退火）。在此過程中，引物與單鏈 DNA 模板仍然按照堿基互補(bǔ)的方式配對。延伸是指引物與 DNA 模板按堿基互補(bǔ)的原則配對后，在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP 為反應(yīng)原料，進(jìn)行體外的半保留復(fù)制，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的新鏈。經(jīng)重復(fù)循環(huán)變性———退火———延伸 3 個(gè)過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一次循環(huán)需2￣4min，2￣3h 就能將目的基因擴(kuò)增、放大幾百萬倍。過去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCR 幾小時(shí)便可完成。PCR 技術(shù)的發(fā)明是分子生物學(xué)的一項(xiàng)革命，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，并被迅速推廣和應(yīng)用到其他領(lǐng)域。

在眾多的污染物中，生物污染（病原菌、病毒及其它一些有害生物）直接威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的檢測方法需要對樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，往往要花上幾天乃至數(shù)周的時(shí)間，而且有些致病菌或病毒難以人工培養(yǎng)，給檢測帶來困難，而 PCR 技術(shù)的應(yīng)用，克服了上述不足。與傳統(tǒng)生物檢測方法相比，PCR 方法不僅檢測時(shí)間短、靈敏度高，還可以檢測出一些依靠培養(yǎng)法不能檢測的微生物種類。PCR方法已經(jīng)在微生物檢測中有了比較深入而廣泛的研究，并取得了較好的應(yīng)用成果。

PCR 技術(shù)反應(yīng)能夠被自然界中一些物質(zhì)所抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些離子及糖類物質(zhì)等可以干擾 Taq 聚合酶的作用。同樣，環(huán)境水樣在濃縮、保存和提純過程中可能從環(huán)境及中間處理環(huán)節(jié)帶來一些潛在的 PCR 反應(yīng)抑制劑，例如 EDTA、十二烷基硫酸鈉等；另外還可能有一些共存物質(zhì)抑制 PCR 反應(yīng)。這些抑制劑一方面可能抑制 PCR反應(yīng)，另一方面還可能造成假陽性結(jié)果。因而，研究環(huán)境樣品中待擴(kuò)增DNA 或 RNA 的提純技術(shù)以消除抑制物的影響是十分重要的。由于DNA 的檢測并不意味著必須使用活細(xì)胞，因而任何可以提供核酸物質(zhì)的樣品都可以進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，也就是說 PCR 不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，尤其是在水體衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)中不能確定所檢出的病毒粒子是否具有感染能力，這是一個(gè)待解決的問。

近些年來，基于 PCR 的基本原理，許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維，對 PCR 技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使 PCR 技術(shù)得到了進(jìn)一步地完善，并在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的 PCR 技術(shù)，如熒光 PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、原位 PCR、單細(xì)胞 PCR 等，以及這些技術(shù)相互融合，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究打開了一扇扇新大門，為分子生物學(xué)研究的深入開展提供了高質(zhì)量的技術(shù)保障，也為環(huán)境保護(hù)提供了方便、快捷、靈敏的檢測手段。

3 生物芯片（Bioships）

生物芯片是一種通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)將生物探針分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因組 DNA、多肽、抗原、抗體等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)表面而構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可以對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA 以及其他生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和大信息量的檢測。

在環(huán)境監(jiān)測和環(huán)境保護(hù)上，可以利用生物芯片快速檢測污染微生物或有機(jī)化合物對環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害。在環(huán)境監(jiān)測方面的應(yīng)用主要有：水質(zhì)控制、檢測藥物、食物添加劑或化學(xué)物質(zhì)毒性以及環(huán)境中有害細(xì)菌的監(jiān)測。利用生物芯片技術(shù)能夠同時(shí)快速地檢測多種環(huán)境中的常見致病菌。

4 PCR- DGGE 技術(shù)

由于 DNA 分子中 AT 堿基對與 GC 堿基對的鍵間結(jié)合力的不同，造成不同序列的 DNA 分子的解鏈溫度不同，解鏈需要的變性劑的濃度也不同。當(dāng) DNA 分子在含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，序列不同的 DNA 片段就會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，形成向三個(gè)方向延伸的片段，這種形狀的DNA 分子電泳遷移速度相應(yīng)降低很多，這樣不同序列的 DNA片段滯留于凝膠的不同位置，染色后會看到形成一條條的譜帶。

為調(diào)節(jié)目的序列的解鏈程度，取得好的分離效果，通常采用 GC夾板的形式，在 PCR 引物的 5 末端連接上一段長度為 30￣50 堿基富含GC 的核苷酸序列，使相差一個(gè)堿基的序列也能分辨分離。該技術(shù)主要包括 6 個(gè)步驟：（1）樣品總 DNA 提取；（2）樣品 16SrDNA 片段的 PCR 擴(kuò)增及純化；（3）制膠；（4）樣品的 DGGE 分析；（5）染色；（6）割膠測序。

由于 PCR－ DGGE 技術(shù)克服了傳統(tǒng)微生物學(xué)方法的局限性，自Muyzer等開辟了 DGGE 在微生物生態(tài)領(lǐng)域研究的先河以來，該技術(shù)迅速發(fā)展成為環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一。近年來，DGGE 用于環(huán)境微生物種群的研究越來越多，涉及的領(lǐng)域也越來越廣泛，在國外 DGGE 技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于活性污泥、生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物多樣性檢測、微生物鑒定以及種群演替等方面的研究。

PCR－ DGGE 技術(shù)只能分離較小的片段（達(dá) 500bp），較長的片段分離率下降，限制了用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量。由于某些種類 16SrDNA 的拷貝之間的異質(zhì)性問題及異源核酸雙鏈分子的檢出可能會導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量的過多估計(jì)。在有些情況下，不同類型的細(xì)菌種群 16SrDNA 有著相同的遷移行為，一條DGGE 條帶是由不同細(xì)菌種群序列組成，這可能會低估環(huán)境微生物的種群多樣性。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，環(huán)境監(jiān)測技術(shù)也在向更精細(xì)、更準(zhǔn)確、更靈敏的方向發(fā)展。同時(shí)，生物技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域中日趨重要的地位和作用，充分說明拓寬學(xué)科的研究領(lǐng)域，加強(qiáng)學(xué)科間的交流、滲透和合作，對于科學(xué)的整體發(fā)展和進(jìn)步是至關(guān)重要的。

[1]李宗義,邵強(qiáng),郭偉云等.用于環(huán)境監(jiān)測的生物傳感器 [J].生物技術(shù).2005.15(4): 95-98.

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X83[文獻(xiàn)碼]B

1000-405X（2016）-5-415-2