陳國娟，袁莉剛，李聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州　730070)

?

不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸組織VEGF及其受體分布比較

陳國娟，袁莉剛，李聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 探索VEGF及其受體(VEGFR2)在繁殖期和繁殖間期成年牦牛睪丸組織中的分布特點并進行比較分析.【方法】 應用免疫組織化學SP法檢測VEGF及其受體(VEGFR2)分布特征并通過IPP圖像分析軟件進行定量統(tǒng)計.【結果】 免疫組織化學顯示，成年牦牛睪丸中，VEGF表達于各級生精細胞以及Sertoli細胞和Leydig細胞，強表達于長形精子，小血管內(nèi)皮細胞見強陽性表達，肌樣細胞未見表達；其受體VEGFR2表達于各級生精細胞及Sertoli細胞，且Leydig細胞內(nèi)強表達，小血管弱表達；性成熟牦牛睪丸組織中VEGF和 VEGFR2的表達繁殖期高于繁殖間期，但無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05).【結論】 VEGF及其受體在性成熟牦牛睪丸組織中表達豐富，表明其參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調節(jié)，不同繁殖期有一定的表達差異，提示其表達與牦牛發(fā)情活動密切相關.

關鍵詞：牦牛；繁殖期；免疫組織化學；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體2

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的主要調節(jié)者；它們不僅在內(nèi)皮細胞上有表達，在非內(nèi)皮細胞上也有表達[1].研究表明，在人體內(nèi)許多與生殖有關的細胞都有VEGF及其受體(VEGFR)的表達，是體內(nèi)與生殖有關的重要生長因子之一[2].VEGF及其受體作為血管形成和生成的主要調節(jié)者，在哺乳動物的睪丸血管發(fā)生及微環(huán)境維持中有重要作用[3].Caires等[4]在牛睪丸中研究發(fā)現(xiàn)，VEGF維持生殖細胞存活和調節(jié)精子發(fā)生.研究報道，高原低氧誘導哺乳動物細胞VEGF表達量增加，VEGF特異作用于血管內(nèi)皮細胞，使血管內(nèi)皮細胞增殖，促進新生血管形成，改善微循環(huán)并增加血管的通透性，使高原動物生殖器官對低氧的適應能力顯著加強[5].Wu等[6]對牦牛血管內(nèi)皮生長因子基因的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子作為一種血管生成的關鍵調節(jié)器和一個內(nèi)皮細胞的有絲分裂原，在高海拔適應性中起著重要作用.牦牛作為青藏高原的特產(chǎn)家畜，對高寒低氧環(huán)境具有極強的適應性.姚紀元[7]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因表達隨絨山羊毛囊周期性變化，且在生長旺盛期表達明顯升高，具有一定的季節(jié)性表達規(guī)律.Wagener等[8]研究表明，VEGF在麆鹿繁殖期精子表達為高峰期，繁殖期結束開始回歸.牦牛作為典型的季節(jié)繁殖動物[9]，VEGF及其受體在其睪丸的表達是否呈季節(jié)性變化，目前尚未見相關報道.鑒于此，本研究應用免疫組織化學SP法檢測比較性成熟時的繁殖期及繁殖間期牦牛睪丸組織中VEGF及VEGFR2的分布特征并對其進行定量分析，探討VEGF及其受體與睪丸生精功能和高原適應性之間的關系以及季節(jié)性表達的意義，進一步了解牦牛睪丸高原適應性的原理.

1材料與方法

1.1試驗動物

牦牛睪丸樣品采自青海省西寧市屠宰場，參照趙光前等[10]牦牛年齡門齒鑒別法，所采樣品均為性成熟牦牛睪丸，分繁殖期(7～9月)5、7、8歲各兩對，繁殖間期(1～2月)5歲3對，7歲和8歲各兩對.以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用.

1.2試驗試劑

VEGF兔抗鼠多克隆抗體(bs-1313R)和VEGFR2兔抗鼠多克隆抗體(bs-0565R)購自北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023，由美國ZYMED公司生產(chǎn))購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018和ZLI-9502)購自北京中杉金橋生物技術有限公司.

1.3切片制備

樣品固定和切片制備：新鮮組織樣品稱質量測量，記錄解剖數(shù)據(jù)，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚 5 μm)，相鄰切片3套分別用于VEGF和VEGFR2免疫組織化學SP法染色及陰性對照.

1.4免疫組織化學SP法檢測VEGF和VEGFR2分布

免疫組織化學SP法進行染色；切片脫水、脫蠟后，進行高溫高壓抗原修復，后加一抗，一抗用VEGF和VEGFR2兩種多克隆抗體均按1∶400比例稀釋，陰性對照組用0.01 mol/L的PBS代替一抗(VEGF、VEGFR2)，4 ℃過夜，后孵育、清洗、顯色、脫水、透明、封片.然后顯微鏡進行觀察、照相.

1.5圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學切片，每組切片中隨機選取5張，在400倍顯微鏡(OlympusDP71)下進行拍照，每張切片采集5個視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，測定陽性反應物的平均光密度，并用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結果用平均值±標準差表示.

2結果與分析

2.1不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸組織中VEGF及其受體的分布

VEGF與VEGFR2免疫組織化學陽性反應呈棕黃色，在不同繁殖季節(jié)性成熟(5、7、8歲)牦牛睪丸中均有表達.VEGF繁殖間期與繁殖期表達定位相同，主要定位于各級生精細胞(精原細胞、初級精母細胞、精子細胞及多種形態(tài)精子)、血管內(nèi)皮細胞、Sertoli細胞和Leydig細胞，肌樣細胞未見表達(圖1A-F)；其受體VEGFR2表達定位與VEGF相同，表達于繁殖間期與繁殖期性成熟牦牛睪丸各級生精細胞、Sertoli細胞、Leydig細胞強表達，血管弱表達(圖1G-L)；兩種因子均在精子變態(tài)期表達較強.

A-C：繁殖間期牦牛睪丸VEGF表達；D-F：繁殖期牦牛睪丸VEGF表達；G-I：繁殖間期牦牛睪丸VEGFR2表達；J-L：繁殖期牦牛睪丸VEGFR2表達。免疫組織化學染色，標尺示20 μm；CV：微血管；LC：Leydig細胞；ST：生精小管.圖1　不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體(VEGFR2)的表達Fig.1　The expresstion of VEGF in yak testis in different breeding season

2.2不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體免疫組織化學檢測比較

VEGF與VEGFR2在性成熟牦牛(5、7、8歲)睪丸免疫組織化學表達平均光密度統(tǒng)計結果表明，二者在睪丸表達定位基本相同，同一繁殖期與不同繁殖期睪丸內(nèi)表達均無統(tǒng)計差異(P>0.05)，但繁殖期VEGF及其受體表達檢測數(shù)值均略高于繁殖間期(表1-2、圖2).

表1　高原牦牛睪丸VEGF及其受體VEGFR2平均

表2　不同繁殖季節(jié)牦牛睪丸VEGF及其受體

圖2　不同繁殖季節(jié)VEGF及VEGFR2在高原牦牛睪丸中免疫組織化學表達的變化Fig.2　The immunohistochemistry expression of VEGF and VEGFR2 in yak testis in different breeding season

3討論與結論

睪丸局部微環(huán)境受到各類細胞因子的調節(jié)，VEGF作為內(nèi)皮細胞特異性強效有絲分裂原，被公認為是作用最強的血管通透因子，在體內(nèi)VEGF只有通過與其受體相結合才能發(fā)揮生物學效應，VEGFR2是其最主要的受體之一，VEGFR2是血管生成和發(fā)育的主要調節(jié)者，它們不僅在內(nèi)皮細胞上有表達，在非內(nèi)皮細胞上也有表達[11].研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體在雄性生殖系統(tǒng)中通過刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，血管生成及其內(nèi)皮細胞遷移，增加血管通透性等來調節(jié)睪丸功能[12].有關嚙齒類動物睪丸的研究發(fā)現(xiàn)[13]，VEGF 表達量減小可抑制睪丸微血管的生成，進而影響睪丸微環(huán)境的調節(jié).本研究發(fā)現(xiàn)牦牛睪丸中VEGF及其受體廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞，提示VEGF可通過與VEGFR2相結合，作用于睪丸間質毛細血管，影響睪丸微環(huán)境循環(huán)，為生精細胞的增殖和分化創(chuàng)造條件.已有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧時有機體局部氧化與抗氧化作用失衡，引起氧化應激，導致組織損傷[14].Verratti等[15]對不同年齡大鼠睪丸蔓狀靜脈叢的細胞氧化應激研究表明，高原環(huán)境中大鼠可能存在特殊的適應性機制，表現(xiàn)為對氧化應激反應降低.本研究牦牛睪丸中VEGF及其受體廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞，結合VEGF及其受體的生理作用，提示VEGF及其受體在牦牛睪丸微血管系統(tǒng)高原適應性調節(jié)中發(fā)揮一定作用.

研究證實，VEGF及其受體能夠維持牛睪丸生殖細胞的存活和調節(jié)精子的發(fā)生，對其生精過程也起著很重要的作用[4].Korpelainen等[16]曾報道VEGF轉基因小鼠的生精細胞內(nèi)有VEGF基因信號且出現(xiàn)于各級精子細胞.本研究發(fā)現(xiàn)牦牛睪丸中VEGF及其受體表達于各級生精細胞，提示其可能與精子發(fā)生密切相關，參與精子發(fā)生的整個過程；其在長形精子的強表達則表明VEGF可能參與精子變態(tài)過程.王訓立等[17]研究雄性恒河猴性成熟的睪丸發(fā)現(xiàn)，生精小管內(nèi)繁殖期較非繁殖期各級生精細胞豐富.研究報道，VEGF在麆鹿繁殖期精子表達為高峰期，繁殖期結束開始回歸[8].劉輝等[18]研究報道，季節(jié)性繁殖動物生精功能在繁殖期出現(xiàn)高峰.牦牛為典型的季節(jié)繁殖動物，其繁殖季節(jié)為6～11月份[9].本研究中，性成熟期牦牛睪丸VEGF 及其受體在不同繁殖季節(jié)表達略有差異，呈現(xiàn)繁殖期略高于繁殖間期，提示VEGF及其受體對睪丸局部微環(huán)境的調節(jié)存在一定季節(jié)差異，這可能與牦牛進入繁殖期密切相關.

Ai等[19]在大鼠睪丸中的研究顯示，VEGF同時表達于Sertoli細胞和Leydig細胞，Collin等[20]在人睪丸Sertoli細胞和Leydig細胞的研究亦有相同結果.劉輝等[18]研究綿羊睪丸顯示，其Sertoli細胞和Leydig細胞呈現(xiàn)一定的季節(jié)性變化，表現(xiàn)為繁殖季節(jié)兩種細胞形態(tài)和數(shù)量上均優(yōu)于非繁殖季節(jié).朱俊峰等[12]研究不同年齡段牦牛睪丸時發(fā)現(xiàn)，Leydig細胞在牦牛睪丸生精過程中發(fā)揮重要作用.本研究中VEGF及其受體同時表達于Sertoli細胞和Leydig細胞，且受體強表達于Leydig細胞，提示VEGF及其受體可能通過自分泌或旁分泌的形式，參與精子發(fā)生及局部微環(huán)境的調節(jié)，對Leydig細胞也有一定調節(jié)作用，在維持繁殖期睪丸功能的正常發(fā)揮中有著至關重要的地位.

綜上所述，VEGF及其受體在性成熟牦牛睪丸組織中表達豐富，通過調節(jié)血管發(fā)生及其通透性，從而降低低氧對睪丸的影響，以自分泌或旁分泌形式參與精子發(fā)生及睪丸局部微環(huán)境調節(jié)，影響睪丸的功能，不同繁殖期存一定表達差異，這與牦牛發(fā)情活動密切相關.

參考文獻

[1]馬莉,田宏,張浩,等.VEGF、VEGFR2在青春期大鼠睪丸、附睪及附睪精子上的表達[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2010,19(2):147-151

[2]Ergun S,Kilic N,Fiedler W,et al.Vascular endothelial growth factor and its receptors in normal human testicular tissue[J].Molecular and Cellular Endocrinology,1997,131(1):9-20

[3]曹穎楠,谷博,姜懷志，等.VEGF與雄性哺乳動物生殖機能關系的研究進展[J].經(jīng)濟動物學報,2011,15(4):212-215

[4]Caires K C,Avila J,Mclean D J.Vascular endothelial growth factor regulates germ cell survival during establishment of spermatogenesis in the bovine testis[J].Reproduction,2009,138(4):667-677

[5]Marti H H,Risau W.Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors[J].Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,1998,95(26):15809-15814

[6]Wu X Y,Liang C N,Ding X Z,et al.Association of novel single-nucleotide polymorphisms of the vascular endothelial growth factor-A gene with high-altitude adaptation in yak (Bosgrunniens)[J].Genetics and Molecular Research,2013,12(4):5506-5515

[7]姚紀元.VEGF基因在遼寧絨山羊毛囊周期性變化中表達的研究[D].吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學,2008

[8]Wagener A,Blottner S,G?ritz F,et al.Circannual changes in the expression of vascular endothelial growth factor in the testis of roe deer (Capreoluscapreolus)[J].Animal Reproduction Science,2010,117(3/4):275-278

[9]彭巍.牦牛繁殖調控技術研究進展[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2013,43(6):41-43

[10]趙光前,窮理.牦牛年齡門齒鑒別法[J].中國牦牛1994,37:60

[11]Ergun S,Luttmer W,Fiedler W,et al.Functional expression and localizization of vascular endothelial growth factor and its recaptors in the hunman epididymis[J].Biology of Reproduction,1998,58(1):160-168

[12]Hwang G S,Wang S W,Tseng W M,et al.Effect of hypoxia on the release of vascular endothelial growth factor and testosterone in mouse TM3 Leydig cells [J].American Journal of Physiology,2007,292(6)：1763-1769

[13]Young K A,Nelson R J.Short photoperiods reduce vascular endothelial growth factor in the testes of Peromyscus lecopus[J].American Journal of Physiology-regulatory Integrative and Comparative Physiology,2000,79(3):1132-1137

[14]Maiti P,Singh S B,Sharma A K,et al.Hypobaric hypoxia induces oxidative stress in rat brain[J].Neurochemistry International,2006,49(8):709-716

[15]Vrrratti V,Digiulio C,Berardinelli F,et al.Pampiniform plexus and oxidative stress during chronic hypoxia and hyperoxia[J].International Journal of Immunopathology & Pharmacology,2008,21(2):353-357

[16]Korpelainen E I,Karkkainen M U,Tenlmnen A,et al.Overexpression of VEGF in Testis and Epididymis Causes Infertility in Transgenic Mice:Evidence for Nonendothelial Targets for VEGF [J].Journal of Cell Biology,1998,143(6):1705-1712

[17]王訓立,周建華,范春梅.雄性恒河猴生殖功能的季節(jié)性變化的研究[J].中國獸醫(yī)學報，2002(4):66-71

[18]劉輝,崔定中.綿羊睪丸內(nèi)分泌細胞的季節(jié)性變化[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2001,24(1):55-57

[19]Ai Q Y,Tian H,Zhang J,et al.Expressions of VEGF and Flt-1 in the testis,epididymis and epididymal sperm of adolescent rats[J].National Journal of Andrology,2008,14(10):871-875

[20]Colliu O,Bergh A.Leydig ceils secrete factors which increase vascular permeability and endothelial cell proliferation[J].International Journal of Andrology,1996,19(4):221-228

[21]朱俊峰,谷來鳳,閆振龍,等.不同發(fā)育階段牦牛睪丸生精小管和間質細胞的形態(tài)學變化[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報,2014,49(4):18-22

(責任編輯趙曉倩)

Distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons

CHEN Guo-juan,YUAN Li-gang,Li Cong,YAN Zhen-long

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To explore and analyze the distribution characteristics of VEGF and its receptor (VEGFR2) in adult yak testis in breeding and non-breeding seasons.【Method】 This study used immunohistochemical SP technique to identify the distribution of VEGF and its receptor (VEGFR2) ,and IPP (Image-Pro Plus) statistics method was used to quantitative statistics.【Result】 Immunohistochemistry showed that VEGF was expressed in the spermatogenic cells,sertoli cells ,and leydig cells,and strongly expressed in the elongated sperma and vascular endothelial,no expressed in the muscle cells.VEGF' receptor (VEGFR2) was expressed in the spermatogenic cells and sertoli cells,strongly expressed in leydig cells.While weakly expressed in vessel weakly.The data showed that the average optical density of VEGF and VEGFR2 was higher in breeding season than non-breeding season in adult yak testis,but there was no significantly difference(P>0.05).【Conclusion】 VEGF and its receptors were expressed in abundance in adult yak testis,it showed that they participate in the spermatogenesis and regulate the local microenvironment.While there was certain difference in expression in different breeding season,it indicated that it closely related to the oestrous period in different seasons.

Key words：yak;breeding season;immunohistochemistry;VEGF;VEGFR2

通信作者：袁莉剛，女，教授，博士，主要研究方向為動物發(fā)育生物學.E-mail:yuan2918@126.com

基金項目：國家自然科學基金項目“牦牛睪丸高原適應性形態(tài)學研究”(31160488)；甘肅省自然科學研究基金“雙峰駝隱睪神經(jīng)遞質分布及調控機理研究”(145RJZA223).

收稿日期：2015-03-03；修回日期：2015-04-23

中圖分類號：S 852.16

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0013-05

第一作者：陳國娟(1990-)，女，主要研究方向為動物發(fā)育生物學.E-mail:hopeissnow@163.com