王濤　馬思聰　戚星星　湯曉寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤介入科

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·論著·

KPNA2基因沉默對人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵襲能力的影響

王濤馬思聰戚星星湯曉寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤介入科

【摘要】目的觀察核轉(zhuǎn)運蛋白基因α2(Karyopherin α-2，KPNA2)基因沉默對人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及侵襲能力的影響。方法將KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒用LipofectaminTM 2000方法瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404，轉(zhuǎn)染后48 h應用蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染細胞中KPNA2蛋白表達。采用MTT法檢測基因沉默細胞增殖能力，采用Transwell法檢測基因沉默細胞侵襲能力。結(jié)果SMMC7721細胞株對照組mRNA為1.02±0.13，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的0.37±0.07(t=10.78，P<0.01)；肝癌Bel7404細胞株對照組mRNA為1.05±0.17，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的0.36±0.06 (t=9.38，P<0.01)。肝癌SMMC7721細胞株對照組蛋白定量值為0.96±0.10，高于轉(zhuǎn)染組的0.42±0.05(t=11.83，P<0.01)；肝癌Bel7404細胞株對照組蛋白定量值為0.93±0.09，高于轉(zhuǎn)染組的0.48±0.06(t=10.19，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404細胞株在24、48和72 h時對照組增殖能力高于轉(zhuǎn)染組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SMMC7721細胞株對照組侵襲能力值為126.20±21.61，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的51.13±10.2 (t=7.68，P<0.01)；肝癌Bel7404細胞株對照組侵襲能力值為125.124±8.04，高于siRNA轉(zhuǎn)染組的55.20 ±18.54 (t=8.48，P<0.01)。結(jié)論KPNA2基因沉默可以調(diào)節(jié)人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】KPNA2；肝癌細胞株；SMMC7721；Bel7404；增殖能力；侵襲能力

核轉(zhuǎn)運蛋白基因α 2(Karyopherin α 2，KPNA2)是核定位信號區(qū)域的一種結(jié)合蛋白，其作為核孔靶向復合物的組成部分，通過與核定位信號相結(jié)合的方式將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運入核內(nèi)發(fā)揮作用，從而達到調(diào)節(jié)相應基因表達的目的[1]。目前相關(guān)研究表明，KPNA2與細胞癌變密切相關(guān)，KPNA2基因沉默及過表達對人膀胱癌細胞株5637的增殖能力有調(diào)節(jié)作用[2]。然而，目前有關(guān)KPNA2基因與肝癌的相關(guān)性的研究較少，其確切分子機制尚不清楚。本研究通過采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)對人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404進行KPNA2基因沉默，探討KPNA2基因干擾對肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為深入研究KPNA2基因在肝腫瘤中異常表達的分子機制提供新思路。

資料和方法

一、材料與試劑

人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404購自于美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。脂質(zhì)體LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司。質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購自美國TIANGEN公司。兔抗人多克隆抗體KPNA2和TNFRSF12A購自美國Abcam公司，兔抗人多克隆抗體GAPDH購自美國R&D Systems公司。PCR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。細胞增殖活性測試MTT試劑盒購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量(WB)檢測試劑盒購自美國TIANGEN公司。iRNA提取試劑盒購自美國TIANGEN公司。

二、試驗方法

(一)靶向KPNA2干擾質(zhì)粒的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中KPNA2基因序列(序列號：NM_002266)，使用小干擾RNA (small interfering RNA，siRNA)設(shè)計軟件，并用BLAST工具確保其序列為特異性序列。設(shè)計合成的siRNA序列為：正義鏈5′-CCGUUGAUGAACCUCUUAATT-3′；反義鏈5′-UUAAGAGGUUCAUCAACGGTT-3′；同時設(shè)計一對陰性對照序列：正義鏈5′-UCCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUC-GGAGAATT-3′。siRNA合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學合成。

(二)細胞培養(yǎng)將冷凍保存于液氮中的肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404復蘇后，接種于含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，然后置于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2～3 d進行1次培養(yǎng)基更換，當細胞鋪滿瓶壁約80%后，用0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，接種于新的培養(yǎng)瓶中。

(三)分組和轉(zhuǎn)染本試驗設(shè)轉(zhuǎn)染組和對照組，轉(zhuǎn)染組采用KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，對照組采用無關(guān)序列RNA進行轉(zhuǎn)染。每組細胞設(shè)6個平行復孔，每孔約1×106個細胞。放入CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞生長融合鋪滿孔壁約至80%時，采用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000方法進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時用無血清的DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余轉(zhuǎn)染過程按照說明書進行。

(四)RT-PCT的基因檢測KPNA2引物上游5′- CTGCCCGTCTTCACAGATTCA -3′，引物下游5′- GCGGAGAAGTAGCATCATCAGG -3′；內(nèi)參GAPDH引物上游5′- GAGCGAGATCCCTCCAA-AAT -3′， 內(nèi)參引物下游5′- GGCTGTTGTCATAC-TTCTCATGG -3′。PCR擴增條件為[3]：94 ℃預變性5 min，然后再94 ℃變性40 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，總共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。而后將PCR產(chǎn)物在3%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min后觀察結(jié)果。

(五)蛋白質(zhì)印跡法檢測KPNA2蛋白表達將各組已轉(zhuǎn)染的細胞加入蛋白裂解緩沖液中提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。將總蛋白用8% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至NC膜上進行轉(zhuǎn)膜，而后置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫反應1 h，然后TBST洗2次，每次10 min。分別加入KPNA2一抗(1∶1000稀釋)、內(nèi)參GAPDH一抗(1∶1000稀釋)維持4℃溫育過夜。次日TBST洗膜3次，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中作用1 h。暗室中ECL試劑盒顯影觀察結(jié)果。

(六)細胞增殖活性檢測將細胞接種于96孔板中，每孔細胞濃度為1×105/mL，采用逆向轉(zhuǎn)染的方法同步轉(zhuǎn)染KPNA2及對照，然后分別于24、48和72 h每孔加入10 μL MTT(0.5 mg/mL)，37 ℃溫育3 h后去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，并于37 ℃孵育10 min，中間取出搖晃1次，使結(jié)晶充分溶解。測定各孔吸光度值，計算6孔的平均值。

(七)細胞侵襲力檢測將轉(zhuǎn)染前后的5×104個肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404接種于上室，將20%的100 μL DMEM培養(yǎng)基置于Transwell小室的底室，細胞培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，此時細胞已遷移到膜的底面。對膜過濾的細胞用4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，結(jié)晶紫染色5 min，光學顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野(×200)內(nèi)遷移細胞的數(shù)量進行定量。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間的比較采用t檢驗；重復測量的資料采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、轉(zhuǎn)染siRNA對KPNA2 mRNA水平的影響

結(jié)果顯示，肝癌SMMC7721細胞中對照組和siRNA轉(zhuǎn)染組mRNA分別為1.02±0.13和0.37±0.07；肝癌Bel7404細胞中對照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為1.05±0.17和0.36±0.06。與陰性對照組比較，KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細胞后，轉(zhuǎn)染組KPNA2 mRNA水平顯著下降，且差異有統(tǒng)計學意義(t=10.78，P<0.01；t=9.38，P<0.01)。

二、轉(zhuǎn)染siRNA對KPNA2蛋白表達水平的影響

結(jié)果顯示，肝癌SMMC7721細胞中對照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.96±0.10和0.42±0.05；肝癌Bel7404細胞中對照組和siRNA轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.93±0.09和0.48±0.06。與陰性對照組比較，KPNA2 siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細胞后，轉(zhuǎn)染組KPNA2蛋白表達水平顯著下降(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.83，P<0.01；t=10.19，P<0.01)。

A. SMMC7721細胞株 B. Bel7404細胞株

三、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對增殖能力的影響

SMMC7721和Bel7404細胞株增殖能力結(jié)果顯示，兩細胞株的組別與時間存在交互作用(F=27.9，P<0.01；F=13.6，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404細胞株增殖能力的兩兩比較結(jié)果顯示，在24、48和72 h時對照組的吸光度值高于轉(zhuǎn)染組的值，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與0 h的吸光度值相比，24、48和72 h兩組均增高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結(jié)果表明SMMC7721和Bel7404細胞株轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯受到抑制，見表1，圖2。

±s)

注：△表示與對照組比較P<0.05；▲表示與0 h比較P<0.05；*表示重復測量F檢驗P<0.05

圖2　SMMC7721和Bel7404細胞株個時間點的增殖能力

四、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對侵襲能力的影響

SMMC7721和Bel7404細胞株侵襲能力結(jié)果顯示，與對照組比較，轉(zhuǎn)染組的侵襲能力值均低于對照組的值，且差異有統(tǒng)計學意義(t=7.68，P<0.01；t=8.48，P<0.01)。該結(jié)果表明SMMC7721和Bel7404細胞株轉(zhuǎn)染后，其侵襲能力明顯受到抑制，見表2。

±s)

討論

KPNA2基因位于染色體17q23-q24，長度為1981 bp，編碼產(chǎn)物是含529個氨基酸的核轉(zhuǎn)運蛋白[4]。KPNA2是Karyopherin輸入蛋白家族的成員，其主要作用是通過運載細胞質(zhì)中的效應蛋白分子(如轉(zhuǎn)錄因子)穿過核膜進入細胞核，從而達到在核內(nèi)調(diào)節(jié)效應基因或其他信號分子的表達[4]。KPNA2作為新近發(fā)現(xiàn)的一個候選癌基因，與其相關(guān)的研究主要集中在乳腺癌、食管癌、卵巢癌病理特征或預后關(guān)系[5-7]，而關(guān)于KPNA2基因在腫瘤中表達調(diào)控的機制研究較少。

研究發(fā)現(xiàn)，KPNA2基因沉默和過表達可以調(diào)節(jié)人膀胱癌細胞株5673的增殖能力[2]、遷移能力和侵襲能力[8]。KPNA2在肝癌組織中存在高表達，但在癌旁正常肝組織中低表達，且KPNA2的高表達與肝癌的分期、病理分級呈正相關(guān)[4, 9]；然而有關(guān)KPNA2基因沉默對肝癌細胞基因表達，增殖能力和侵襲能力的調(diào)節(jié)作用仍然不清楚。RNA干擾是目前一種常用的基因沉默技術(shù)，通過與外源或內(nèi)源雙鏈RNA相結(jié)合從而達到在生物體內(nèi)誘導特異性基因沉默的目的[2]。本研究選用適度表達KPNA2的人肝癌SMMC7721和Bel7404細胞株作為細胞模型進行相關(guān)研究，并設(shè)計合成靶向siKPNA2干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染SMMC7721和Bel7404細胞。

本研究結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌SMMC7721、Bel7404細胞株KPNA2的mRNA測量值和KPNA2蛋白表達水平顯著下降，表明siRNA轉(zhuǎn)染能達到有效抑制KPNA2和KPNA2蛋白表達水平。與陰性對照組比較， siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌SMMC7721、Bel7404細胞株增殖能力和侵襲能力均得到了有效抑制。大多數(shù)細胞內(nèi)信號傳導通路是通過細胞質(zhì)中的一些效應分子進入細胞核，并調(diào)節(jié)效應基因或其他信號分子的表達實現(xiàn)的。較小的效應分子例如離子和相對分子質(zhì)量<20～40×103的蛋白，能通過擴散作用直接穿過核孔復合物；而相對分子質(zhì)量>40×103的蛋白要想穿過核膜進入細胞核，必須通過核孔復合物的轉(zhuǎn)運才能通過核孔[2]。KPNA2就是其中一種運載蛋白，因此對人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404進行KPNA2基因沉默，能夠抑制其運載效應分子進入細胞核進行調(diào)節(jié)效應基因和其他信號分子表達，從而達到抑制肝癌SMMC7721、Bel7404細胞株增殖和侵襲的能力的目的。

綜合上述，通過RNAi技術(shù)沉默KPNA2可以調(diào)節(jié)人肝癌細胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵襲能力?？梢詫PNA2作為抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的期望靶點，通過抑制其基因表達，達到阻止腫瘤增殖和生長的目的。

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(本文編輯：錢燕)

The impacts of KPNA2 gene silencing on the proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the impacts of Karyopherin α-2 (KPNA2) gene silencing on proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404. MethodsHuman hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404 were transiently transfected with KPNA2 siRNA through adoption of LipofectaminTM 2000. Protein immunoblotting was performed to detect KPNA2 protein expression in transfected cells at 48 hours after transfection. MTT assay was carried out to assess proliferative capability of gene silencing cells, and Transwell assay was used to evaluate their invasion ability. ResultsRelative mRNA level of KPNA2 in control group of SMMC7721 and Bel7404 was higher than that in siRNA-transfected group (1.02±0.13 vs. 0.37±0.07, t=10.78, P<0.01; 1.05±0.1 vs. 70.36±0.06, t=9.38, P<0.01, respectively). Relative protein level in control group was higher than that in transfected group (0.96±0.10 vs. 0.42±0.05, t=11.83, P<0.01; 0.93±0.09 vs. 0.48±0.06, t=10.19, P<0.01, respectively). Proliferative capacity of control groups was stronger than that in transfected groups at 24h, 48h and 72h respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). Invasive capacity in control group was more powerful than that in siRNA-transected group (126.20±21.61 vs. 51.13±10.2, t=7.68, P<0.01; 125.124±8.04 vs. 55.20 ±18.54, t=8.48, P<0.01, respectively ). ConclusionKPNA2 gene silencing could adjust the proliferative capacity and invasive ability of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404.

【Key words】KPNA2; Hepatocarcinoma cell lines; SMMC7721; Bel7404; Proliferative capacity ; Invasion ability

(收稿日期：2015-09-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email: zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金項目：本項課題受國家自然科學基金(青年項目)資助(81201678)