鄭盛　楊涓　劉瓊　樓維新

650011　云南省第三人民醫(yī)院肝病中心(鄭盛，楊涓)；解放軍第五三三醫(yī)院肝病科(劉瓊，樓維新)

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·論著·

經(jīng)肝固有動(dòng)脈自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化的療效及安全性

鄭盛楊涓劉瓊樓維新

650011云南省第三人民醫(yī)院肝病中心(鄭盛，楊涓)；解放軍第五三三醫(yī)院肝病科(劉瓊，樓維新)

【摘要】目的觀察經(jīng)肝固有動(dòng)脈行自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)移植治療失代償期肝硬化的療效及其安全性。方法將2012年6至2013年6月解放軍第五三三醫(yī)院肝病科收治的84例失代償期患者隨機(jī)分為移植組36例和對(duì)照組48例。對(duì)照組予以基礎(chǔ)治療(護(hù)肝、降黃、對(duì)癥和支持治療)，移植組在基礎(chǔ)治療上行經(jīng)肝固有動(dòng)脈注入自體BMSC治療。觀察兩組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、總膽紅素(TBil)、凝血酶原時(shí)間(PT)、終末期肝病模型評(píng)分(MELD)的變化情況，分別在4、12、24、48周進(jìn)行隨訪；兩組肝功能指標(biāo)比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)，治療后不同時(shí)間各肝功能指標(biāo)的比較用F檢驗(yàn)及LSD兩兩檢驗(yàn)，兩組之間肝癌發(fā)生率和病死率比較應(yīng)用四格表χ2檢驗(yàn)。結(jié)果治療4周后，移植組腹水消退15例(41.7%)，腹脹減輕21例(58.3%)，下肢水腫減輕13例(36.1%)，對(duì)照組分別為15例(31.3%)、20例(41.7%)和11例(22.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。移植組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)；對(duì)照組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD評(píng)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.698、2.652，P均>0.05)。移植組與對(duì)照組相比，治療后第4周ALT、Alb、TBil、PT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.727，P>0.05)；治療后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)。隨訪至第48周，移植組與對(duì)照組病死率及肝癌發(fā)生率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.815、6.286，P均>0.05)。全部患者在移植術(shù)中，移植術(shù)后近期未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥。結(jié)論經(jīng)肝固有動(dòng)脈自體BMSC移植治療失代償期肝硬化是一種安全、有效的方法，可作為肝移植治療的過(guò)渡或補(bǔ)充治療。

【關(guān)鍵詞】肝硬化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植，自體；肝動(dòng)脈；治療

肝硬化是我國(guó)常見(jiàn)疾病和主要的死亡原因之一[1]。各種原因?qū)е碌母斡不蛇M(jìn)一步發(fā)展至肝功能衰竭。肝移植已被證實(shí)是各種原因造成的肝功能衰竭最有效的治療方法，但由于供肝源有限、移植后的免疫排斥反應(yīng)以及高額的治療費(fèi)用使得肝移植的廣泛應(yīng)用受到限制[2]。干細(xì)胞具有自我更新和分化能力，在特定條件下，它可分化為不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)在一定的微環(huán)境中，可向肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞分化，有助于改善肝硬化患者的肝功能，從而進(jìn)一步改善肝硬化患者的臨床癥狀[4]。本研究采用經(jīng)肝固有動(dòng)脈行自體BMSC移植治療失代償期肝硬化，以評(píng)價(jià)其療效和安全性。

資料和方法

一、研究對(duì)象

2012年6至2013年6月在解放軍第五三三醫(yī)院肝病科住院的失代償期肝硬化患者84例，其中男51例，女33例，年齡40～68歲，平均年齡(56.5±4.6)歲。所有入選患者肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)肝病診療管理規(guī)范》白皮書(shū)[5]，其中乙型肝炎肝硬化37例，丙型肝炎肝硬化12例，酒精性肝硬化18例，混合性肝硬化(乙型肝炎/丙型肝炎+酒精性肝硬化)14例，血吸蟲(chóng)性肝硬化3例。肝功能分級(jí)Child-Pugh B 級(jí)54例，Child-Pugh C 級(jí)30例。所有患者術(shù)前存在不同程度乏力、納差、腹脹、胸水、腹水、下肢水腫、脾大等癥狀和體征，均經(jīng)過(guò)影像學(xué)檢查(包括腹部B 超、CT或MRI)及各項(xiàng)檢驗(yàn)，明確診斷為肝硬化。排除標(biāo)準(zhǔn)為有肝臟及其他臟器腫瘤、嚴(yán)重的心肺疾病、肝腎綜合征、肝性腦病、近1年接受過(guò)干擾素或糖皮質(zhì)激素治療者。所有患者入院后均給予對(duì)癥、支持治療。所有措施都在患者知情同意下進(jìn)行，并簽署相關(guān)知情同意書(shū)；該研究經(jīng)過(guò)解放軍第五三三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、治療方法

(一)對(duì)照組對(duì)照組患者給予還原型谷胱甘肽、多烯磷脂酰膽堿、門冬氨酸鉀鎂和維生素C等加入液體中靜脈滴注，1次/d；同時(shí)限鈉、限水和利尿，未給予輸注白蛋白治療。

(二)移植組在對(duì)照組基礎(chǔ)治療的同時(shí)，給予經(jīng)肝固有動(dòng)脈自體BMSC移植治療。進(jìn)入手術(shù)室后，患者取平臥位，選取兩側(cè)髂后上棘部位為骨髓穿刺點(diǎn)，常規(guī)消毒后鋪巾，在穿刺點(diǎn)部位以2%利多卡因進(jìn)行局部浸潤(rùn)麻醉，直至骨膜處，然后使用18號(hào)骨髓穿刺針垂直穿刺，進(jìn)入骨髓腔后予以固定，抽出骨髓。兩側(cè)穿刺點(diǎn)共抽取患者骨髓血200 mL，予以7500單位的肝素鈉進(jìn)行抗凝，然后在實(shí)驗(yàn)室利用密度離心方法進(jìn)行骨髓干細(xì)胞的體外分離及純化，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原標(biāo)記為CD34-、CD45-且CD29+、CD44+、CD90+的濃縮的單核細(xì)胞，在移植組中采集的間充質(zhì)干細(xì)胞均達(dá)到1.0×106/kg體質(zhì)量，在4℃的保存條件下送至介入室。在數(shù)字減影血管造影機(jī)下，采用Seldinger技術(shù)，局麻下穿刺右側(cè)股動(dòng)脈，置入5F動(dòng)脈鞘，引入5F R-H肝動(dòng)脈導(dǎo)管，置于肝固有動(dòng)脈，造影了解血管分布，進(jìn)一步確定無(wú)腫瘤樣異常血管團(tuán)，然后將分離好的BMSC懸液緩慢注入肝內(nèi)。術(shù)后拔出動(dòng)脈鞘，加壓包扎穿刺部位，平臥24 h，常規(guī)對(duì)癥處理。

(三)療效觀察術(shù)后觀察指標(biāo)包括患者臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及影像學(xué)檢查。術(shù)后4、12、24和48周分別復(fù)查ALT、Alb、TBil、PT等指標(biāo)，并進(jìn)行MELD評(píng)分，術(shù)后12周復(fù)查肝臟超聲檢查或CT。根據(jù)臨床癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，分為：有效(臨床癥狀有1項(xiàng)以上減輕，體征有1項(xiàng)以上改善，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)2項(xiàng)以上好轉(zhuǎn))，無(wú)效(臨床癥狀和體征沒(méi)有改善，實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)無(wú)好轉(zhuǎn))。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、基線特征比較

對(duì)兩組肝硬化患者的年齡、性別、生化學(xué)指標(biāo)及MELD評(píng)分方面進(jìn)行比較，結(jié)果兩組患者基線特征基本一致，見(jiàn)表1。

二、癥狀和體征改善情況

治療4周后，移植組腹水消退15例(41.7%)，腹脹減輕21例(58.3%)，下肢水腫減輕13例(36.1%)，對(duì)照組分別為15例(31.3%)和20例(41.7%)，11例(22.9%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。

三、生化學(xué)指標(biāo)及MELD評(píng)分

移植組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)，見(jiàn)表2；對(duì)照組治療前及治療后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.698、2.652，P均>0.05)，見(jiàn)表3。

移植組與對(duì)照組相比，治療后第4周ALT、Alb、TBil、PT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.727，P>0.05)，見(jiàn)表4；治療后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)，見(jiàn)表5。

±s)

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注：與移植前比較，aP<0.05

注：與移植前比較，aP<0.05

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四、隨訪情況

至48周移植組共死亡6例，2例死于上消化道出血，2例死于肝功能衰竭，1例死于肝性腦病，1例死于肝癌；對(duì)照組共死亡10例，3例死于肝功能衰竭，3例死于上消化道出血，2例死于肝性腦病，1例死于繼發(fā)感染，1例死于肝癌。兩組病死率分別為16.7%和20.8%(χ2=4.815，P>0.05)。移植組1例(2.78%)和對(duì)照組1例(2.08%)發(fā)生肝細(xì)胞癌(χ2=6.286，P>0.05)。

五、不良反應(yīng)

36例自體BMSC移植的肝硬化患者中，除1例患者出現(xiàn)低熱及輕微骨痛以外，余患者未發(fā)現(xiàn)其他明顯不良反應(yīng)及并發(fā)癥。

討論

干細(xì)胞是人體內(nèi)最原始的細(xì)胞，是一種具有多分化潛能和自我復(fù)制功能的未分化細(xì)胞，大量研究證明干細(xì)胞不僅可分化為中胚層細(xì)胞，還分化為內(nèi)胚層及外胚層細(xì)胞，表明干細(xì)胞可以跨系、跨胚層分化，具有強(qiáng)大的可塑性[6]。同時(shí)，干細(xì)胞具有化學(xué)趨向性[7]。根據(jù)干細(xì)胞的這些特性，臨床可用于治療各種細(xì)胞或組織損傷性疾病，如肺纖維化[8]、糖尿病足[9]、潰瘍性結(jié)腸炎[10]等。目前，臨床上用于治療肝硬化的干細(xì)胞，主要包括外周血干細(xì)胞、自體骨髓干細(xì)胞和臍血干細(xì)胞[11]。

國(guó)外學(xué)者[12]報(bào)道，自體BMSC移植可促進(jìn)受損肝臟的功能恢復(fù)和再生，能改善血清膽紅素、Alb、凝血國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值、生活質(zhì)量、Child-Pugh評(píng)分及MELD評(píng)分，治療后未見(jiàn)不良反應(yīng)。Piscaglia等[13]研究結(jié)果顯示G-CSF可促進(jìn)BMSC遷移到肝臟，同時(shí)增強(qiáng)內(nèi)源性肝細(xì)胞，即卵圓細(xì)胞修復(fù)肝臟。Han等[14]報(bào)道，PBSC移植治療失代償期肝硬化20例，可以改善肝臟的合成功能。上述研究均提示自體BMSC移植治療肝臟疾病有效。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，治療組4周后，患者的ALT較治療前有明顯好轉(zhuǎn)，TBil從12周始較治療前有明顯好轉(zhuǎn)，肝臟的合成功能指標(biāo)以及MELD評(píng)分從12 周始較治療前有明顯改善。對(duì)照組治療后4周，患者的ALT較治療前也有明顯好轉(zhuǎn)，TBil從12周始較治療前也有明顯好轉(zhuǎn)；但MELD評(píng)分未見(jiàn)有明顯變化。隨訪至48周，兩組病死率及肝癌發(fā)生率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮BMSC移植不會(huì)增加肝細(xì)胞癌發(fā)生率，同時(shí)因BMSC移植不能從根本上糾正患者肝硬化病因，因而未能減少患者病死率，但考慮BMSC可能定向分化為肝樣細(xì)胞及自身的旁分泌等作用，有助于改善肝硬化患者的肝功能。

目前，進(jìn)行BMSC移植治療肝病的途徑主要有經(jīng)肝動(dòng)脈、門靜脈和外周靜脈等[15]。姚鵬等[16]采用經(jīng)肝動(dòng)脈注入自體BMSC治療慢性肝衰竭患者，證實(shí)其在改善患者癥狀和降低病死率方面效果明顯。Pai等[17]將BMSC經(jīng)肝動(dòng)脈輸入到酒精性肝硬化患者肝內(nèi)，患者膽紅素水平明顯下降，Child-Pugh評(píng)分改善。其機(jī)制可能是肝動(dòng)脈介入輸注細(xì)胞可使干細(xì)胞在肝臟局部產(chǎn)生高濃度的細(xì)胞群，有利于其在肝臟中定植并發(fā)揮作用。

本研究采用經(jīng)肝固有動(dòng)脈移植自體BMSC治療36例失代償期肝硬化患者，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療前后患者癥狀改善明顯，治療組與對(duì)照組在治療后48周相比，血清肝功能及MELD評(píng)分改善方面有顯著性差異。國(guó)內(nèi)外的基礎(chǔ)及臨床研究均表明，BMSC移植治療肝硬化主要有以下優(yōu)點(diǎn)[18]：①BMSC移植來(lái)源方便，不受供體缺乏的限制，還可免除免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；②治療效果明顯，可顯著改善癥狀，在移植8～12周后干細(xì)胞開(kāi)始分化，隨著新的肝細(xì)胞不斷增加，受損肝組織得到修復(fù)，肝功能逐漸恢復(fù)；③與活體肝移植相比費(fèi)用低廉，且可以為肝臟移植贏得等待供體的時(shí)間；④技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)小，手術(shù)本身過(guò)程并不復(fù)雜，加上采用的是介入微創(chuàng)手段，安全性較好，患者能夠耐受手術(shù)。

綜上所述，失代償期肝硬化患者在常規(guī)治療的前提下應(yīng)用自體BMSC移植治療，雖不能給患者帶來(lái)治愈性的效果，但可以在很大程度上控制肝硬化的進(jìn)展，提高肝硬化患者的生存質(zhì)量，是在藥物及原位肝移植治療之外可供選擇的治療方案。

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(本文編輯：易玲)

Clinical study of autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation through proper hepatic artery for decompensated cirrhosis patientsZHENGSheng1,YANGJuan1,LIUQiong2,LOUWei-xin2.1.DepartmentofLiverDiseases,YunnanThethirdPeople’sHospital,Kunming650011,China; 2.DepartmentofLiverDiseases,TheNo.533HospitalofPeople’sLiberationArmy,Kunming650000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical therapeutic effect and safety of autologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) transplantation through proper hepatic artery in patients with decompensated liver cirrhosis. MethodsEighty-four patients with decompensated liver cirrhosis, which admitted in Department of Liver Diseases of the No.533 Hospital of People's Liberation Army from 2012 Jun to 2013 Jun, were randomly divided into transplantation group (n=36) and control group (n=48). Patients in control group received routine treatment, while patients in transplantation group received additional autologous BMSC transplantation through proper hepatic artery. Alanine aminotransferase (ALT), albumin (Alb), total bilirubin (TBil), prothrombin time (PT) and model for end stage liver disease (MELD) were evaluated in both groups during follow-up at week 4, 12, 24 and 48, respectively. Comparison of liver function at different time after therapy between two groups carried out by independent t test , F test and LSD test. Incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) and mortality were analyzed by χ2 test. ResultsFour weeks after treatment, there were 15 cases (41.7%) ascites subsiding, 21 cases (58.3%) abdominal distention disappearing and 13 cases (36.1%) edema of lower limbs relieving in transplantation group, while there were 15 cases (31.3%), 20 cases (41.7%) and 11 case (22.9%) in control group, respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). In transplantation group at week 4, 12, 24, 48, there were significant improvements in ALT, Alb, TBiL, PT and MELD (F=6.172, 9.795, 10.961, 11.198, 19.652, P=0.000, respectively) than those at baseline. In control group, some parameters, including ALT, Alb and TBiL, had significant improvement (F=5.594, 13.664, 12.612, P=0.000, respectively), while other parameters, including PT and MELD, did not changed before and after therapy. At week 48, ALT, Alb, TBiL, PT and MELD showed significant differences between transplantation and control groups (t=5.477, 8.830, 6.371, 11.362, 9.426, P<0.05, respectively). No significant differences were observed in incidence of HCC and mortality (χ2=4.815、6.286, P<0.05, respectively). Additionally, no severe adverse effects occured in patients during and after transplantation. ConclusionAutologous BMSC transplantation through proper hepatic artery for decompensated liver cirrhosis is a safe and effective therapy, which could be a bridging or a complementary treatment.

【Key words】Cirrhosis; Bone marrow mesenchymal stem cells; Transplantation, autologous; Hepatic artery; Treatment

(收稿日期：2015-08-03)

Corresponding author:ZHENG Sheng, Email: zheng_sheng523@163.com; YANG Juan, Email: 53573885@qq.com

通信作者：鄭盛，Email：zheng_sheng523@163.com； 楊涓，Email：53573885@qq.com

基金項(xiàng)目：云南省自然科學(xué)基金(2012FD095)；云南省教育廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Z125)