李冬云，田黎明，于廣晴，張　純，王為光

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154003)

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急性白血病中聯(lián)合檢測USP22和BMI-1的表達及意義①

李冬云，田黎明，于廣晴，張純，王為光

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：探討急性白血病(AL)患者及健康成人中聯(lián)合檢測特異性泛素蛋白酶22(USP22)和B細胞特異性莫洛尼白血病病毒插入位點1基因(BMI-1)的表達及意義。方法：使用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術半定量檢測32例初治急性白血病患者及26例健康成人外周血中USP22及BMI-1的表達情況。結果：①USP22及BMI-1的表達水平在急性白血病初治組中顯著高于對照組(P<0.05)；且兩者之間呈顯著正相關(r=0.748，P<0.01)。②USP22及BMI-1的表達水平在急性白血病初治組中顯著高于完全緩解(CR)組患者(P<0.05)。③USP22及BMI-1在急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)中的表達水平無明顯差異(P>0.05)。④在初治急性白血病患者中,USP22及BMI-1高表達組的患者CR率均低于其低表達組患者(P<0.05)。結論:AL患者中USP22及BMI-1的表達水平顯著高于健康成人,兩者的表達呈現(xiàn)一致性,且高表達的USP22及BMI-1患者其CR率低，因此檢測該兩者的表達水平對指導急性白血病患者的治療及判斷其預后具有重要意義。

關鍵詞:急性白血??； USP22；BMI-1；RT-PCR

白血病(Leukemia)是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)病率較以往發(fā)病更高[1]，在我國AL比慢性白血病(CL)發(fā)病率高。目前治療白血病的方法包括聯(lián)合化療、造血干細胞移植、生物及基因治療、中醫(yī)中藥等措施，但總體治療效果欠佳。目前的主要任務是研究白血病的發(fā)病機理及可能影響其發(fā)生發(fā)展的生物學標志基因來評價其預后及治療效果，尋找這一過程中任意環(huán)節(jié)的關鍵因素，已成為許多學者研究白血病的新方向，進而研究靶點藥物用于白血病的治療[2]。特異性泛素蛋白酶22屬于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族中的一種泛素特異肽酶，其實現(xiàn)廣泛的生物學功能主要依靠對底物靶分子的去泛素化[3]。USP22對細胞周期發(fā)揮重要的調(diào)控作用，此外，USP22還能和人類染色質(zhì)重塑復合體SAGA(h-SAGA )的亞單位相互作用，使h-SAGA 表現(xiàn)出激活狀態(tài)，從而激活目標基因的轉錄，這一結果是依靠USP22 N末端的鋅指結構和C末端的泛素水解酶活性區(qū)聯(lián)合完成。BMI-1屬于多梳基因家族(Polycomb group，PcG)的一個原癌基因[4]，能對造血干細胞及白血病干細胞的分化、更新等起到重要作用，能直接參與細胞的繁殖與生長，BMI-1在體內(nèi)表達異常時則會誘發(fā)多種腫瘤的發(fā)生。本次實驗，我們意在通過對USP22與BMI-1這兩個指標在初治白血病患者治療前后與正常健康成人外周血中的檢測，探討兩者在急性白血病中的意義。

1資料與方法

1.1病例來源

32例初治AL患者均來源于佳木斯大學附屬第一醫(yī)院血液科自2014-03~2015-06住院患者,男18例,女14例, 年齡18~74歲,中位年齡48歲，其中ALL 10例，AML 22例；AL患者均行一個標準化療程療后，依據(jù)骨髓細胞學分析統(tǒng)計出達完全緩解的患者。26例健康對照組來自同時期健康體檢人群，女11例，男15例，年齡18~70歲，中位年齡42歲。參照張之南主編的《血液病診斷及療效標準》[5]來評價所有患者的診斷及治療效果。

1.2單個核細胞分離和總RNA提取及鑒定

取外周血4mL后肝素抗凝，緩慢加入4mL淋巴細胞分離液，以3000r/min離心12 min,分離出單個的核細胞,采用UNIQ-10柱式Trizol法提取總的RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量及純度。

1.3RT-PCR分析

1.3.1USP22mRNA引物：上游引物5'-GGGAGGAGGCTCACCTCTAA-3'，下游引物為5'-AAAACCATCAACTCGGGCCT-3',產(chǎn)物長度113bp；BM-I1引物：上游引物為:5'-TGGAGAAGAAATGGTCCACTTC-3'；下游引物為: 5'-GTGAGGAAACTGTGGATGAGGA-3'；擴增片段222bp。內(nèi)參GAPDH引物:上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3',下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3',擴增片段長度226bp。

1.3.2按照RT-PCR試劑盒說明，采用一步法RT-PCR對目的基因USP22及BMI-1和內(nèi)參基因GAPDH進行擴增。根據(jù)以下程序擴增：94℃預變性5min；94℃ 45秒，59℃ 30秒，72℃ 60秒,PCR擴增40個循環(huán)，72℃延伸5min。

1.3.3PCR產(chǎn)物電泳：取8μL的擴增產(chǎn)物上樣于2.0%瓊脂糖凝膠中120V電泳25min，紫外投射儀觀察結果，分別以USP22mRNA、BMI-1mRNA、內(nèi)參GAPDH mRNA電泳帶的灰度比值作為結果。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，分別應用獨立樣本t檢驗、Spearman 等級相關分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1USP22及BMI-1在AL和正常對照組的表達

見表1，兩者呈顯著正相關(r=0.748，P<0.05)，見圖1。

表1　USP22及BMI-1在AL和正常對照組的表達

注：*P<0.05,和正常對照組相比。

圖1　USP22及BMI-1的相關性

2.2USP22及BMI-1在AML組和ALL組中的表達

USP22在AML組表達水平為0.412±0.070，在ALL組表達水平為0.436±0.142，兩者無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；BMI-1在AML組表達水平為0.547±0.125，在ALL組表達水平為0.618±0.120，兩者無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表2。

表2　USP22及BMI-1在AML組和ALL組中的表達±s)

注：#P>0.05，和ALL組比較。

2.3AL患者化療后USP22及BMI-1表達水平與完全緩解率的關系

3討論

G. V. Glinsky 等人利用微集陣列技術, 對不同來源組織的腫瘤細胞進行大量分析, 歸納出在多數(shù)細胞中普遍高表達的11個標記基因(即癌死亡基因標簽)，USP22及BMI-1 即為其中的兩個標簽基因。USP22作為腫瘤干細胞基因已被發(fā)現(xiàn)，其可通過增強Myc介導的基因轉錄促進細胞惡變及腫瘤生長,USP22表達降低能使Myc高表達細胞停滯在G1期，減低克隆形成率[6]。 USP22 已被證實在多種腫瘤中高表達，如結前列腺癌、直腸癌、肺癌等，這些研究證實USP22作為原癌基因在癌細胞侵襲和轉移過程中扮演重要角色。大量相關文獻報道，BMI-1在造血系統(tǒng)惡性腫瘤及實體腫瘤中高表達，并且與腫瘤轉移潛能、侵襲、預后、患者耐藥密切相關，其表達水平隨造血細胞的分化而下降，當BMI-1水平異常增高時大量的幼稚細胞無限增殖積累，導致白血病的發(fā)生，這表明BMI-1癌基因能激活人類腫瘤中的腫瘤干細胞，從而表現(xiàn)出強烈的腫瘤轉移性和化療耐藥性。 目前很多實驗證實BMI-1和 USP22在功能上存在交叉重疊：兩者功能均參與水解組蛋白H2B上的泛素；敲除基因表達均導致細胞停滯在G1期；USP22通過BMI-1調(diào)控的通路實現(xiàn)細胞惡性行為[7]。因此，本次實驗從上述論述出發(fā)，采用RT-PCR研究急性白血病患者及健康成人外周血中USP22和BMI-1在急性白血病中的表達及意義，研究結果表明，AL初治患者USP22和BMI-1的表達明顯高于健康成人，且兩者呈正相關關系；根據(jù)急性白血病初治患者中USP22和BMI-1的表達水平，將其高于平均水平為高表達組、低于平均水平為低表達組，發(fā)現(xiàn)USP22和BMI-1的高表達組經(jīng)化療后的CR率低于其低表達組，說明USP22和/或BMI-1高表達患者不易獲得CR。

綜上所述，USP22及BMI-1在急性白血病中關系密切，二者的活化可能會促進急性白血病的發(fā)生發(fā)展、加速急性白血病的進程、影響治療預后等，因此聯(lián)合檢測BMI-1和USP22可能有助于患者分層、判斷患者預后、指導個體化治療有一定的意義。

參考文獻：

[1]段翠翠，王慶國，王為光，等.急性白血病病人XIAP和Caspase-3的表達及其臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2014,37(2):83-84

[2]田黎明，郝翠翠，代建華，等.SIRT1，Ku70在急性白血病中的表達及意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2011,34(2):3-5

[3]徐志陽，田文亮，付雪，等.特異性泛素蛋白酶22在急性白血病細胞中的表達及其臨床意義[J].腫瘤防治研究，2014，41(4)：366-369

[4]Kim SH, Singh SV. The role of polycomb group protein BMI-1 and Notch4 in breast cancer stem cell inhibition by benzyl is othiocyanate [J]. Breast Cancer Res Treat，2015，149 (3): 681-692

[5]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].北京:科學出版社,2009:103-134

[6]Kobayashi T, Iwamoto Y，Takashima K，et al. Deubiquitinating enzymes regulate Hes1 stability and neuronal differentiation [J]. FEBS J，2015，282(13):2475-2487

[7]Yan-Long Liu，Shi-Xiong Jiang，Yan-Mei Yang，et al. USP22 Act as an oncogene by the Activation of BMI-1 Mediated INK4a/ARF Pathway and Akt Pathway[J].Cell Biochem Biophys,2012,62(1):229-235

(收稿日期：2015-05-24)

中圖分類號：R733.7

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)01-0080-02

作者簡介:李冬云(1989～)女，湖南邵陽人，在讀碩士研究生。通訊作者:田黎明(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail：TLM3388@163.com。