劉祥琴

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都　610072)

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原發(fā)性開角型青光眼與SOD2基因多態(tài)性相關(guān)性分析

劉祥琴

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都610072)

[摘要]目的：本實(shí)驗(yàn)擬研究錳超氧化物歧化酶(SOD2)變異在原發(fā)性開角型青光眼(POAG)中的作用。方法：以750例散發(fā)青光眼患者和1 500例正常對(duì)照者，對(duì)rs6917589、rs2842980、rs5746136、rs4880的SOD2單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)用SNaPshot法進(jìn)行基因分型。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)等位基因頻率進(jìn)行分析。結(jié)果：等位基因關(guān)聯(lián)分析表明，rs6917589和rs5746136與POAG有相關(guān)性(P=0.023和P=0.026)。rs2842980和rs4880與POAG無(wú)相關(guān)性(P=0.064和P =0.703)。由這4個(gè)SNP組成的單倍體型ATGT有POAG的趨勢(shì)(P=0.003 2)。結(jié)論：我們的結(jié)果顯示SOD2與POAG的發(fā)生存在相關(guān)性，表明SOD2可能在POAG發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]超氧化物歧化酶2；原發(fā)性開角型青光眼；單核苷酸多態(tài)性

青光眼是全球第二大導(dǎo)致失明的疾病，全世界6 700萬(wàn)人罹難該病[1]。其特點(diǎn)是視野缺陷、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡、視神經(jīng)逐步退化[2]。原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是原發(fā)性青光眼的主要類型，表現(xiàn)為無(wú)明顯原因且虹膜角膜角開放，視神經(jīng)纖維損失通常伴隨著典型的視野的缺損，常見(jiàn)眼壓(intraocular pressure，IOP)升高，進(jìn)展通常是無(wú)痛性視力和明顯視野缺失直到有明顯的、不可逆的視野缺損，最終可能導(dǎo)致失明。

青光眼是一種由多種基因和環(huán)境因素等引起的多因素疾病[3]。家系研究發(fā)現(xiàn)MYOC、OPTN、WDR36這3個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致該病的發(fā)生[4-5]。迄今為止，已報(bào)道了超過(guò)20個(gè)基因或位點(diǎn)與POAG的致病相關(guān)[6]，例如CAV1、CAV2、CDKN2B-AS1、CDKN2A、CDKN2B、TMCO1[7-8]。然而，這些已發(fā)現(xiàn)與POAG有關(guān)的變異不超過(guò)10%的青光眼病例[9,6]，且POAG與這些基因的機(jī)理尚不清楚。

氧化應(yīng)激已在多個(gè)方面證實(shí)為青光眼發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[10-11]，它反映了機(jī)體的活性氧(reactive oxygen species，ROS)失衡。ROS作為第二信使，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)通路。在青光眼病理中，抗氧化酶活性和低分子量抗氧化劑水平證實(shí)了氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。青光眼患者眼睛內(nèi)，氧化和抗氧化的失衡可能會(huì)導(dǎo)致大量的分子變化從而導(dǎo)致這種眼部疾病的發(fā)展?？寡趸溉绯趸锲缁?orgotein superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)被發(fā)現(xiàn)存在于房水。同時(shí),青光眼患者的眼房水也發(fā)現(xiàn)SOD2表達(dá)的變化[13-17]，青光眼患者的血清樣本也表現(xiàn)SOD活性降低[18]。

SOD2基因編碼錳依賴超氧化物歧化酶，它是一種線粒體抗氧化酶，負(fù)責(zé)清除線粒體ROS，防止氧化應(yīng)激反應(yīng)。以前的研究已經(jīng)證明，在沙特人群中SOD2的基因多態(tài)性(SNP rs4880)與POAG有關(guān)聯(lián)[19]。在本研究中，我們擬研究SOD2基因多態(tài)性與POAG的關(guān)系。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象本研究采集2012—2015年到四川省人民醫(yī)院就診的750例青光眼患者和1 500例正常對(duì)照者。經(jīng)四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，并簽署知情同意書。所有的研究對(duì)象都是漢族人，且3代以上親屬都是漢族人口。原發(fā)性開角型青光眼病患納入的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：眼壓(IOP)>22 mmHg，虹膜角膜角開放(Shaffer等級(jí)Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí))；視神經(jīng)損傷，杯盤比高于0.5，視神經(jīng)盤出血,神經(jīng)纖維層和焦損失；視野變化特征測(cè)試通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化自動(dòng)視野測(cè)量[1]；排除先天性青光眼以及任何形式的繼發(fā)性青光眼，如表皮脫落綜合征或眼外傷史。正常對(duì)照人群來(lái)源于本院正常體檢人群，排除了其他眼睛方面疾患。病例組和對(duì)照組性別、年齡大致匹配。病例組患者年齡32～84歲，平均52.22±7.91歲；對(duì)照組年齡35～90歲，平均51.2±9.5歲。對(duì)照組眼壓12.05～19.82 mmHg，平均杯盤比對(duì)照組0.32；病例組患者組眼壓是23.0～37.5 mmHg，平均杯盤比是0.80。

1.2SOD2基因單核苷酸多態(tài)性分析在該研究中,我們通過(guò)國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃項(xiàng)目網(wǎng)站(www.hapmap.org)選擇了SOD2基因的4個(gè)標(biāo)簽SNP：rs6917589、rs2842980、rs5746136和rs4880[20]，然后對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行了4個(gè)SNP位點(diǎn)分型。具體方法是將靜脈血用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，用酚氯仿抽提乙醇沉淀法提取基因組DNA，采用Takara公司PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，再采用ABI公司的單堿基末端延伸法(SNaPshot法)并利用ABI公司的ABI 3130遺傳分析儀和Genemapper軟件對(duì)SOD2基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)Hardy-Weinberg平衡(HWE)公式對(duì)每個(gè)SNP的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。病例組和對(duì)照組等位基因和基因型頻率采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到P值、優(yōu)勢(shì)比(OR值)和95%可信區(qū)間(CI)，并通過(guò)Bonferroni進(jìn)行校正。P值<0.012 5(0.05/4)被認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS15.0。通過(guò)軟件Haploview4.2進(jìn)行SNP之間連鎖不平衡檢驗(yàn)和單倍型分析，得到D′和r2值[21]。

2結(jié)果

2.1等位基因分布的單核苷酸多態(tài)性分析所有SNP的等位基因分型結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明單核苷酸多態(tài)性基因型分型結(jié)果沒(méi)有明顯的錯(cuò)誤，并且所選擇的研究對(duì)象隨機(jī)性好，無(wú)地域、人群種族偏差。4個(gè)標(biāo)簽SNP的等位基因和基因型的分布和相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示。

表1　SOD2和POAG相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)這4個(gè)SNP與POAG存在顯著相關(guān)(P>0.012 5)。關(guān)聯(lián)分析顯示 rs6917589和rs5746136等位基因的分布可能與POAG相關(guān)，存在相關(guān)性趨勢(shì)(rs6917589的P=0.023，OR=0.86，95%CI：0.76～0.97，rs5746136的P=0.026，OR=0.86，95%CI=0.76～0.98)。而rs2842980和rs4880位點(diǎn)與POAG的發(fā)生沒(méi)有相關(guān)性(P=0.064和P=0.703)。rs6917589和rs5746136等位基因G在病例組合對(duì)照組中頻率存在較明顯差異，病例組中分別為0.462和0.528，而對(duì)照組為0.574和0.563。

此外,我們還分別按照隱形和顯性遺傳模式分析了這4個(gè)SNP與POAG的相關(guān)性。由于統(tǒng)計(jì)模型在這項(xiàng)研究中應(yīng)用，有意義的P值應(yīng)該是<0.004 2[0.05/(4個(gè)snp×3模型)]。只有在隱性模式下rs6917589和rs5746136與POAG有顯著性相關(guān)(P=0.001 8和0.000 6，OR=0.73和0.71，95%可信區(qū)間為0.60～0.89和0.58～0.86)。見(jiàn)表2。另外2個(gè)SNP：rs2842980和rs4880的顯性和隱性遺傳模式?jīng)]有發(fā)現(xiàn)與POAG存在相關(guān)性。

表2　隱性和顯性遺傳模式下4個(gè)SOD2基因上SNP和POAG相關(guān)性分析

2.2連鎖不平衡和單倍體相關(guān)性分析經(jīng)Haploview軟件進(jìn)行分析，SNP之間兩兩配對(duì)連鎖不平衡顯示rs6917589和rs5746136有很強(qiáng)的連鎖不平衡性(D’=0.98,r2=0.94)，其他的SNP之間連鎖度不高。見(jiàn)圖1。

圖1　SOD2中4個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系

4個(gè)SNP產(chǎn)生的單體型ATGT是POAG的風(fēng)險(xiǎn)單倍體，與POAG有關(guān)聯(lián)，P值為0.003 2。然而，其他單體型與POAG沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。

3討論

SOD2基因和POAG之間的相關(guān)性研究目前較新，除了歐洲和沙特外[22,19]，目前中國(guó)人群的相關(guān)性研究還很少。在本研究中，我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23]，研究了4個(gè)SOD2基因與POAG患者相關(guān)的SNP。本研究結(jié)果顯示，在我們所研究的對(duì)象中，rs6917589和rs5746136等位基因頻率與POAG有輕微的相關(guān)性。P值分別為0.023和0.026。rs6917589和rs5746136與隱性遺傳模式的POAG有顯著性相關(guān)性，P值為0.001 8和0.000 6。這4個(gè)SNP所組成的單體型ATGT也與POAG的發(fā)生有相關(guān)性趨勢(shì)(P=0.003 2)。這些結(jié)果表明，SOD2基因的多態(tài)性可能是導(dǎo)致青光眼的發(fā)病機(jī)理。同時(shí)，rs4880與POAG之間沒(méi)有非常明顯的關(guān)聯(lián)性也與以前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[19,22]。

人類SOD2基因位于6號(hào)染色體q25.3，編碼的SOD2蛋白屬于鐵/錳超氧化物歧化酶家族。它編碼一個(gè)線粒體蛋白質(zhì)形成同源四聚體，并且每個(gè)亞基結(jié)合一個(gè)錳離子。SOD2蛋白結(jié)合的氧化磷酸化過(guò)程中的生成的超氧化物，并將它們轉(zhuǎn)換成過(guò)氧化氫和2價(jià)氧分子。據(jù)報(bào)道，SOD2主要在線粒體中清除活性氧(ROS)，防止氧化應(yīng)激反應(yīng)。由于人類的眼睛對(duì)氧化應(yīng)激特別敏感，過(guò)度光照、紫外線輻射和環(huán)境污染都會(huì)導(dǎo)致活性氧的生成失控，抗氧化機(jī)理失敗，ROS就可引起眼組織脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸損傷。迄今為止，氧化應(yīng)激是青光眼的病因之一[24-25,13]，青光眼患者房水SOD2基因的表達(dá)增加[26,11]。此外已證明在POAG患者中，主要的抗氧化酶包括SOD2活性有所改變[27,14]。但是，迄今為止POAG患者為防止氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致SOD2活性下降的原因還未確定,也不清楚SOD2基因的SNP突變與類型相關(guān)聯(lián)。盡管已有一些SOD2基因多態(tài)性與POAG等多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究報(bào)告，由于研究對(duì)象種族的不同，SOD2多態(tài)性的基因型分布與疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性可能不同。此外,SOD2基因的多態(tài)性導(dǎo)致青光眼易感的確切機(jī)理還不清楚。直到現(xiàn)在,我們所知,除了3個(gè)先前的研究外，還沒(méi)有更多的有關(guān)SOD2多態(tài)性和青光眼發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道[19,22-23]。

在一項(xiàng)愛(ài)沙尼亞人群中的SOD2基因多態(tài)性與青光眼的病例-對(duì)照相關(guān)性研究中，共有病例239例，對(duì)照185例研究。研究發(fā)現(xiàn)SNP rs2842980與青光眼發(fā)生有顯著相關(guān)性而其他5個(gè)SNP(包括rs6917589、rs5746136和rs4880)等位基因頻率沒(méi)有顯著差異。此外，另一個(gè)由226例開角型青光眼、139例原發(fā)性閉角型青光眼(PACG)患者和403例正常對(duì)照組成沙特阿拉伯人群的研究也證明了SNP rs4880和POAG及PACG無(wú)顯著相關(guān)性[28,22]。2015年，Zhou等[23]進(jìn)行了中國(guó)人群中416例病例和997例正常對(duì)照的SOD2與POAG相關(guān)性研究，我們的結(jié)果與之接近，但是在隱性遺傳模式下，Zhou等研究結(jié)果表明rs6917589與POAG相關(guān)性不明顯，而我們的結(jié)果顯示rs6917589在與隱性模型的POAG存在關(guān)聯(lián)性，這可能與我們的樣本數(shù)增加有關(guān)系。

通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，我們的研究印證了SOD2基因和POAG存在一定的相關(guān)性。POAG和正常對(duì)照中，s6917589和rs5746136的等位基因分布頻率差異較大。SNP rs5746136與隱性遺傳模式POAG有顯著聯(lián)系(P=0.003 155)。然而，為了避免多重檢驗(yàn)造成的誤差我們經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后，rs6917589和rs5746136在青光眼和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P> 0.012 5)。連鎖不平衡(LD)分析表明，這2個(gè)SNP高度連鎖，這與國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃項(xiàng)目中國(guó)人群的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果相同。在本項(xiàng)研究中，rs2842980和rs4880未發(fā)現(xiàn)與POAG相關(guān)性。但rs2842980與愛(ài)沙尼亞人群的青光眼發(fā)生有顯著相關(guān)(P=0.03)[19]。對(duì)照我們和以前的結(jié)果來(lái)看，SOD2多態(tài)性與POAG的關(guān)系還是有所不同。這可能是由于人群不同，SNP等位基因頻率有所差異。因此，相關(guān)性研究還需要進(jìn)一步在不同群體間增加樣本量。為了確定SOD2突變可能對(duì)青光眼的風(fēng)險(xiǎn)，我們進(jìn)行了單體型分析。研究結(jié)果表明，ATGT這種單體型與POAG的發(fā)生有關(guān)聯(lián)(P=0.003 2)。因此，為了避免漏掉真正POAG易感基因，SOD2在青光眼的發(fā)病機(jī)理中所起的作用需要進(jìn)行更多的動(dòng)物模型和人類遺傳流行病學(xué)研究。

綜上所述,我們的研究結(jié)果證明, SOD2多態(tài)性可能在原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。我們將在今后的研究中增加研究樣本并從SOD2基因的功能方面研究其多態(tài)性導(dǎo)致POAG的原因。

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Correlation Analysis of SOD2 and Primary Open Angle Glaucoma

LIU Xiangqin

(Institute of Laboratory Medicine,Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan People’s Hospital,Sichuan Chengdu610072,China)

[Abstract]Objective:To investigate SOD2 variants whether playing a important role in POAG.Methods:This study included 750 POAG patients and 1 500 control subjects.Four SOD2 tag single nucleotide polymorphisms(SNPs): rs6917589,rs2842980,rs5746136 and rs4880 were gottengenetic typing by SNaPshot method in POAG.The genotype and allele frequencies were evaluated with χ2 tests.Results:Allelic correlation analysis showed that there were the statisticaldifferences in the allelic distributions between POAG cases and controls in rs6917589 and rs5746136(P=0.023 and P=0.026, respectively); The allele and genotype frequency in SNPs rs2842980 and rs4880 showed no statistically significant difference between POAG cases and controls(P=0.064 and P=0.703,respectively). Haplotype ATGT generated from the four SNPs had a trend of association with POAG (P=0.003 2).Conclusion:SOD2 is relevant to POAG and may play a important role in the development of POAG.

[Keywords]SOD2;POAG;SNPs

(收稿日期：2016-02-23)

[中圖分類號(hào)]R775.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.008

優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160315.1416.004.html

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