董　翔　?！「√斩ú?/p>

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧　大連　116011)

?

血清基質金屬蛋白酶-9水平及其基因多態(tài)性與頸動脈斑塊易損性的相關

董翔常庚陶定波

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連116011)

〔摘要〕目的探討基質金屬蛋白酶(MMP)-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動脈斑塊易損性之間的相關性。方法選取2011年3月至2013年4月在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且發(fā)病時間在48 h之內(nèi)的腦梗死患者271例，根據(jù)B超檢查結果，分為斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組，利用酶聯(lián)免疫吸附法對兩組患者血清MMP-9水平進行檢測，采用PCR-酶切反應過程對MMP-9基因多態(tài)性進行測定。結果斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩(wěn)定組(P<0.05)；斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組T/T和C/T基因型頻率高于斑塊穩(wěn)定組，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI 1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組T/C的OR=1.56(95%CI 1.07～2.83，P<0.05)。結論MMP-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動脈斑塊易損性密切相關，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點多態(tài)性測定作為臨床患者頸動脈斑塊易損性判斷的早期標志物。

〔關鍵詞〕基質金屬蛋白酶-9；基因多態(tài)性；頸動脈斑塊；腦梗死

腦梗死是嚴重危害老年人群健康的腦血管疾病，嚴重影響老年患者及家屬生活質量〔1〕，早期發(fā)現(xiàn)腦梗死高危因素并采取積極的預防措施，對于減少腦梗死發(fā)生及改善患者預后具有十分重要的意義。研究表明〔2,3〕，頸動脈粥樣硬化是腦血管疾病的獨立危險因素，頸動脈斑塊的易損性是引發(fā)腦梗死的重要潛在危險因素和病理基礎。因此，積極尋找影響頸動脈斑塊易損性的可能因素顯得尤為重要?；|金屬蛋白家族(MMPs)是一種鈣鋅離子依賴性蛋白酶超家族，主要在細胞外基質(ECM)降解中發(fā)揮作用，有研究指出〔4,5〕，MMPs可以通過破壞斑塊結構和纖維帽成分而造成斑塊加速破裂，從而影響斑塊的穩(wěn)定性。MMP-9是MMPs家族較為重要的成員之一，有研究報道〔6〕，粥樣斑塊內(nèi)MMP-9呈現(xiàn)高表達。本研究通過探討腦梗死患者頸動脈穩(wěn)定性和易損性斑塊患者之間MMP-9血清水平的差異，進一步從基因水平上分析MMP-9基因多態(tài)性與頸動脈斑塊易損性之間的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年3月至2013年4月在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且發(fā)病時間在48 h之內(nèi)的腦梗死患者271例，所有患者均行頸動脈B超檢查，根據(jù)檢查結果，參照文獻報道中關于頸動脈斑塊分類標準〔7〕：①斑塊穩(wěn)定組：B超下示頸動脈呈高回聲，共計147例，男91例，女56例，平均年齡(64.7±13.4)歲；②斑塊易損組：B超下示頸動脈斑塊呈低回聲，共計124例，男79例，女45例，平均年齡(66.3±11.7)歲。所有患者均符合中華醫(yī)學會神經(jīng)學會關于腦梗死的診斷標準〔8〕，同時排除腦動脈炎、心源性腦梗死等其他原因導致的腦梗死，并發(fā)重要臟器衰竭的患者和嚴重全身感染者，以及患有惡性腫瘤和近2個月有服用降脂藥物或抗血小板治療等藥物史者。所有研究對象均進行了知情同意。

1.2臨床資料收集記錄患者性別、年齡、血壓、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史等基本資料，并于入院第2日抽取患者晨起空腹血9 ml，分裝3支試管，5 ml用于生化檢查，采用日立7600-020型全自動生化儀對患者空腹血糖(Glu)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進行檢測；另外兩支試管各2 ml，一管用于基因組DNA抽取，另一管用于MMP-9血清含量檢測，兩者均凍存于-80℃冰箱備用。所有患者均采用彩色多普勒超聲儀對雙側頸總動脈內(nèi)中膜厚度(IMT)進行檢測，IMT≥1.25 mm定義為粥樣斑塊。

1.3檢測試劑人MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自廈門慧嘉生物，用于血清MMP-9血清水平檢測；Pfu DNA聚合酶購自美國Invitrogen公司，Tris飽和酚購自北京華越洋生物，限制性內(nèi)切酶PaeI及其緩沖液購自美國MBI公司，PCR純化試劑盒購自上海華工生物，并由上海華工生物完成DNA測序。

1.4MMP-9多態(tài)性檢測

1.4.1DNA的提取利用低滲溶血-酚法由白細胞中提取，利用KY009核酸蛋白測定儀對DNA進行檢測，確定提取的濃度，并根據(jù)A260/A280值確定PCR擴增模板。

1.4.2聚合酶鏈反應(PCR)擴增MMP-9啟動子區(qū)-1562C/T位點及其側翼區(qū)，上游引物A為：5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物B為：5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，擴增產(chǎn)物為435 bp，反應條件為緩沖液2.5 μl×10，dNTP(分別10 mmol/L)0.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Pfu DNA聚合酶2 U，加RNase-Free Water至總體積達到25 μl。反應條件：95℃預變性120 s；94℃變性45 s；65℃退火70 s；72℃延伸90 s，反復循環(huán)34次，最終72℃延伸600 s。

1.4.3酶切反應過程采用限制性內(nèi)切酶PaeI對純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切，反應體系包括：1 μg PCR產(chǎn)物，緩沖液2 μl×10，內(nèi)切酶PaeI 2.5 U，加RNase-Free Water至總體積達到20 μl，放置37℃水浴箱，進行酶切16 h，反應產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，進行溴乙啶(EB)染色，使用凝膠成像系統(tǒng)對結果進行判定。

1.5統(tǒng)計學處理基因頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，P>0.05，說明符合H-W遺傳平衡定律，具有良好的代表性。采用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗，相對危險度采用OR及其95%可信區(qū)間(CI)表示。

2結果

2.1兩組患者基本情況比較兩組患者基本情況進行比較發(fā)現(xiàn)，兩組性別、年齡、BMI、血壓、Glu、血脂等基本情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組一般情況比較±s)

2.2不同組患者血清MMP-9水平情況斑塊易損組患者血清MMP-9水平為(24.3±9.1)μg/L，明顯高于斑塊穩(wěn)定組〔(19.4±0.7)μg/L，t=3.821,P<0.001〕。

2.3MMP-9基因多態(tài)性分析結果采用PCR-酶切法對MMP-9基因多態(tài)性進行分析，利用PaeI內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，如果為野生型純合子(基因型C/C)，沒有出現(xiàn)突變，則不能被酶切，只出現(xiàn)一條435 bp的帶；如果為突變型純合子(基因型T/T)，C完全突變?yōu)門，則完全被酶切，出現(xiàn)247 bp和188 bp兩條帶；如果為突變雜合子(基因型C/T)，則被部分酶切，出現(xiàn)435 bp、247 bp和188 bp三條帶，見圖1。

M：Marker；1、4、5：突變型純合子T/T；2：野生型純合子C/C；3：突變雜合子C/T圖1　MMP-9基因多態(tài)性酶切產(chǎn)物凝膠電游圖

2.4兩組患者基因型分布和等位基因分布情況比較斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組患者MMP-9基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.151，P=0.922；χ2=1.327，P=0.159)，說明群體代表性較好。斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組T/C的OR=1.56(95%CI1.07～2.83，P<0.05)，見表2。

表2　兩組患者MMP-9不同基因型頻率和等

3討論

越來越多的研究表明〔9,10〕，急性腦梗死的發(fā)生與頸動脈斑塊的穩(wěn)定性有關，頸動脈斑塊的易損破裂是造成腦梗死發(fā)生的直接原因。細胞外基質是血管壁主要成分，可以保持斑塊的完整性，同時含有膠原物質，能夠保持彈性與韌性，在防止斑塊破裂方面發(fā)揮重要作用，當細胞外基質被過度講解時，將增加斑塊的易損性，導致斑塊破裂。MMP-9主要參與膠原、彈性蛋白和纖維蛋白等的降解，可以破壞斑塊的穩(wěn)定性，增加斑塊易損性，在斑塊破裂過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。本研究提示MMP-9參與ECM的降解，與斑塊的穩(wěn)定性有關。

MMP-9基因位于人染色體20q1 1.2～13.1，在其4個啟動子區(qū)多態(tài)性中，-1562C/T位點變異可能與基因轉錄相關，當發(fā)生C→T突變后，可以產(chǎn)生低活性C/C和高活性C/T、T/T啟動子基因，其中，C/T、T/T啟動子基因可以引發(fā)MMP-9的高表達〔12〕，因此，MMP-9基因多態(tài)性決定了人群對某種疾病的遺傳易感性。本研究說明易損斑塊MMP-9基因發(fā)生了基因突變，(TT+CT)/CC比例增高增加了斑塊損傷的危險性，高活性啟動子基因大量產(chǎn)生，使MMP-9表達增多，從而進一步加速斑塊的破損。斑塊易損組T基因頻率遠高于斑塊穩(wěn)定組，說明在易損斑塊組發(fā)生了C→T突變，產(chǎn)生高活性的啟動子基因型，使MMP-9高表達，進一步破壞斑塊的穩(wěn)定性。從基因水平也解釋了斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩(wěn)定組的原因。

綜述所述，MMP-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動脈斑塊易損性密切相關，其中，-1562C/T位點是頸動脈斑塊易損性的易感基因，其多態(tài)性直接影響斑塊的穩(wěn)定性。因此，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點多態(tài)性測定作為臨床患者頸動脈斑塊易損性判斷的早期標志物，對其危險性進行評估，進而早期發(fā)現(xiàn)易感人群，開展早期的干預，預防頸動脈斑塊易損性的發(fā)生，進而降低腦梗死的發(fā)生率。

4參考文獻

1Liang CC,Hsieh TC,Lin CH,etal.Effectiveness of thermal stimulation for the moderately to severely paretic leg after stroke:serial changes at one-year follow-up〔J〕.Arch Phys Med Rehabil,2012;93(11):1903-10.

2Araki Y,Kumakura H,Kanai H,etal.Prevalence and risk factors for cerebral infarction and carotid artery stenosis in peripheral arterial disease〔J〕.Atherosclerosis,2012;223(2):473-7.

3Awada A.Primary and secondary prevention of ischemic stroke〔J〕.J Med Liban,2011;59(4):213-9.

4Panayiotou AG,Griffin MB,Tyllis T,etal.Association of genotypes at the matrix metalloproteinase(MMP)loci with carotid IMT and presence of carotid and femoral atherosclerotic plaques〔J〕.Vasc Med,2013;18(5):298-306.

5Siefert SA,Sarkar R.Matrix metalloproteinases in vascular physiology and disease〔J〕.Vascular,2012;20(4):210-6.

6Cimmino G,Ragni M,Cirillo P,etal.C-reactive protein induces expression of matrix metalloproteinase-9:a possible link between inflammation and plaque rupture〔J〕.Int J Cardiol,2013;168(2):981-6.

7Bia D,Pessana F,Forcada P,etal.Non-invasive assessment of atherosclerotic plaques effects on the segment-to-segment human carotid visco-elasticity and filtering〔J〕.Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc,2010;20(10):2533-6.

8中華醫(yī)學會全國第四次腦血管學術會議.各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經(jīng)科雜志,1996;29(6):379-80.

9Ding S,Zhang M,Zhao Y,etal.The role of carotid plaque vulnerability and inflammation in the pathogenesis of acute ischemic stroke〔J〕.Am J Med Sci,2008;336(1):27-31.

10Yazdani SK,Vorpahl M,Ladich E,etal.Pathology and vulnerability of atherosclerotic plaque:identification,treatment options,and individual patient differences for prevention of stroke〔J〕.Curr Treat Options Cardiovasc Med,2010;12(3):297-314.

11宋月平，孫菊平，周金英，等.基質金屬蛋白酶-9與頸動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關系〔J〕.醫(yī)學研究與教育，2014；31(2)：4-6.

12Wu HD,Bai X,Chen DM,etal.Association of genetic polymorphisms in matrix metalloproteinase-9 and coronary artery disease in the Chinese Han population:a case-control study〔J〕.Gene Test Mol Biomarkers,2013;17(9):707-12.

〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1344-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.028

通訊作者：常庚(1981-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事癡呆研究。

第一作者：董翔(1975-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。