田少輝　許　磊　李盼祥　趙　瑜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北　保定　071000)

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老年腦出血血腫周圍組織T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3表達(dá)及在腦出血發(fā)病中的意義

田少輝許磊李盼祥趙瑜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000)

〔摘要〕目的分析T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3在老年腦出血血腫周圍組織中的表達(dá)及其意義。方法因腦出血行血腫清除術(shù)老年患者40例根據(jù)手術(shù)距離發(fā)病時間分為≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組，各10例。同時選取遠(yuǎn)離血腫的正常腦組織10例作為對照組。采用免疫組化法檢測TIM-3蛋白表達(dá)，采用RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA表達(dá)。結(jié)果各組TIM-3蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組，且≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組TIM-3及mRNA水平逐漸上升，>24 h且≤72 h組、>72 h組TIM-3及mRNA水平逐漸下降，>24 h且≤72 h組TIM-3及mRNA水平顯著高于其他各組(P<0.05)。結(jié)論TIM-3在腦出血發(fā)病后逐漸升高，至24～72 h升高至頂峰，之后逐漸下降，提示TIM-3可能和腦出血后炎癥反應(yīng)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子；腦出血

急性腦出血(ACH)發(fā)病率約占全部腦血管疾病的30%，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，與高血脂、糖尿病、高血壓相關(guān)〔1〕。作為突發(fā)事件，ACH患者常會出現(xiàn)不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，尤其是氧化應(yīng)激反應(yīng)與腦出血后的炎癥反應(yīng)，血腫壓迫周圍腦組織，誘發(fā)組織缺血、缺氧，釋放大量炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷。 T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3是TIMs家族一員，其蛋白產(chǎn)物為CD4+T細(xì)胞膜表面的一類受體分子，主要表達(dá)于活化CD+Th細(xì)胞膜上，與患者機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞活化、增殖及分化具有密切聯(lián)系〔2〕。本研究分析腦出血行血腫清除術(shù)老年患者腦出血血腫周圍組織TIM-3蛋白與mRNA表達(dá)。

1資料與方法

1.1一般資料我科2012年6月至2015年6月神經(jīng)外科因腦出血行血腫清除術(shù)老年患者40例，年齡64～79歲，平均(68.71±3.75)歲。根據(jù)手術(shù)距離發(fā)病時間，分≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組和>72 h組，各10例。均經(jīng)頭顱CT或MRI診斷，符合1995年第4屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。同時選取遠(yuǎn)離血腫的正常腦組織10例作為對照組。

1.2主要試劑和儀器兔抗人TIM-3多克隆抗體購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，RT-PCR試劑盒和SP試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自上海信裕生物科技有限公司，PCR引物購自寶生物工程(大連)有限公司，Trizol購自福州晶康生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔二抗HRP標(biāo)記購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。YB-6型生物組織包埋機(jī)、YB-6B型烤片機(jī)購自湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所，Leica TP1020型自動脫水機(jī)和RM2125切片機(jī)購自德國Leica公司，BX50 型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。RT-PCR分析儀購自北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司。

1.3檢測方法和觀察指標(biāo)采用免疫組化染色檢測TIM-3蛋白表達(dá)。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后，連續(xù)以5 μm厚度切片，進(jìn)行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟之后，滴加過氧化物酶阻斷液，常溫孵育10 min后，滴加一抗，37℃濕盒中孵育60 min，滴加二抗，常溫孵育10 min后，滴加過氧化物酶-鏈霉親和素溶液，常溫孵育10 min。每步之間用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，完成后，DAB顯色，細(xì)胞核以蘇木精復(fù)染，封片采用中性樹膠。陽性對照為已知陽性片，陰性對照為被PBS代替的一抗。高倍鏡(×400)視野下，隨機(jī)選取20個視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，取平均值為陽性細(xì)胞數(shù)。其中陽性細(xì)胞均為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜有淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。①細(xì)胞質(zhì)無顯色，0分；②胞質(zhì)呈淡黃色云霧狀，1分；③胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，2分；④胞質(zhì)呈均勻深黃色，3分。記錄每張切片中腫瘤細(xì)胞顯色深淺(A、B、C、D)各占的百分?jǐn)?shù)a、b、c、d，計算A×a+B×b+C×c+D×d，總分0分(-)、1分(+)、2分()、總分3分()。采用RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA表達(dá)水平。內(nèi)參基因β-actin的引物序列(299 bp)：上游5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT-3'，目的基因TIM-3引物序列(558 bp):上游5'-CCAAATCCCAGGCATAAT-3'，下游5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'。總RNA采用Trizol法提取，溶解后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)擴(kuò)增DNA片段共30個循環(huán)，凝膠成像系統(tǒng)對于經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

各組TIM-3、mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組，且≤6 h組、>6 h且≤24 h組、>24 h且≤72 h組的TIM-3、mRNA水平逐漸上升，>24 h且≤72 h組、>72 h組TIM-3、mRNA水平逐漸下降，>24 h且≤72 h組TIM-3、mRNA水平顯著高于其他各組(P<0.05)，見表1。

表1　各組TIM-3、mRNA表達(dá)水平比較

與對照組相比：1)P<0.05；與≤6 h組相比：2)P<0.05；與>6 h且≤24 h組相比：3)P<0.05；與>24 h且≤72 h組相比：4)P<0.05；與>72 h組相比：5)P<0.05

3討論

急性腦出血對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響〔4〕。腦出血后腦血腫組織會釋放大量炎癥因子，CD4+T細(xì)胞按照分化與功能特征分為Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞，腦出血后血腫對周圍組織產(chǎn)生直接性壓迫，使血管床縮小，釋放的血管活性物質(zhì)誘發(fā)血管痙攣，導(dǎo)致其發(fā)生系列變化，釋放凝血酶，浸潤炎性細(xì)胞，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，腦出血后缺血體積超過血腫幾倍〔5〕。大量炎癥因子可以使腦微血管通透性及血腦屏障通透性增加，從而使大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子透過崩潰的血腦屏障進(jìn)入腦組織，吸收血腫清除壞死組織的同時也會加重腦出血后繼發(fā)性腦損傷〔6〕。

TIMs蛋白產(chǎn)物為CD4+T細(xì)胞膜表面的一類受體分子，TIM-3是其家族中首位參與T細(xì)胞免疫應(yīng)答的成員，主要表達(dá)于Th1、Th17細(xì)胞等多種細(xì)胞表面，在適應(yīng)性免疫與自然免疫中發(fā)揮重要作用〔7〕。相關(guān)文獻(xiàn)指出〔8〕，TIM-3與其配體半乳凝素-9相結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞，削弱Th1應(yīng)答，促進(jìn)Th1細(xì)胞凋亡。TIM-3可以通過激活Th1細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞數(shù)量與活性，促進(jìn)Th1細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)能力，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答并介導(dǎo)細(xì)胞免疫耐受〔9〕。腦組織出血<6 h時，經(jīng)過細(xì)胞毒性受體傳遞凝血級聯(lián)反應(yīng)與凝血酶，促使乳酸脫氫酶濃度增高，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，隨時間延長，TIM-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，腦組織的壞死層、海綿層逐漸向周圍腦組織擴(kuò)展，擴(kuò)大腦水腫范圍〔10,11〕。腦組織出血>24 h，出血壞死的腦組織出現(xiàn)機(jī)械性壓迫、局部壓力增高、紅細(xì)胞溶解等因素導(dǎo)致神經(jīng)元毒性損害，TIM-3 mRNA表達(dá)隨著出血時間逐漸增強(qiáng)，加重了腦組織不可逆壞死〔12〕。本研究提示TIM-3參與了腦出血早期病理過程，且通過多種調(diào)控機(jī)制，參與腦出血后多種細(xì)胞因子表達(dá)，參與腦出血炎癥反應(yīng)。本研究說明，腦出血患者發(fā)病6 h后Th1與Th17細(xì)胞均被激活，分泌細(xì)胞因子，TIM-3及TIM-3 mRNA參與了腦出血后的病理過程，其水平隨著腦出血時間的延長而逐漸升高，加重患者腦出血后的組織損傷，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)的報道相一致〔13,14〕。

綜上，TIM-3在腦出血發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，其水平在腦出血發(fā)病后逐漸升高，至24～72 h升高至頂峰，之后逐漸下降，提示TIM-3可能和腦出血后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，可能成為腦出血基因治療新靶點(diǎn)。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R743.34

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1325-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.020

通訊作者：許磊(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病、腦腫瘤研究。

基金項(xiàng)目：河北科技發(fā)展項(xiàng)目(No.aj09x416)

第一作者：田少輝(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病、腦腫瘤研究。