趙　鐸　王　丹　崔名雯　齊亞莉

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦病科，河南　鄭州　450000)

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補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方對(duì)EAE大鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞和IL-17的影響

趙鐸王丹崔名雯1齊亞莉2

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腦病科，河南鄭州450000)

〔摘要〕目的探討補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞和腦組織內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-17的影響。方法將60只雌性Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(正常)、模型對(duì)照組(EAE+生理鹽水)、低劑量組(EAE+15 g·kg(-1)·d(-1))、中劑量組(EAE+30 g·kg(-1)·d(-1))及高劑量組(EAE+60 g·kg(-1)·d(-1))。模型建立后持續(xù)灌胃14 d。治療結(jié)束后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD4+、CD8+ T細(xì)胞水平，采用免疫組織化學(xué)方法和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組大鼠側(cè)腦室周圍組織內(nèi)IL-17水平。結(jié)果(1)與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏高，CD8+明顯偏低(P<0.05)；與模型對(duì)照組、低劑量組及中劑量組相比，高劑量組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏低，CD8+明顯偏高(P<0.05)；高劑量組與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯偏高(P<0.05)；與模型對(duì)照組、低劑量組相比，中劑量組和高劑量組明顯偏低(P<0.05)；高劑量組與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方60 g/kg劑量能更好地升高EAE大鼠外周血CD8+ T細(xì)胞同時(shí)降低CD4+ T細(xì)胞和IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

〔關(guān)鍵詞〕補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；CD4+ T細(xì)胞；CD8+ T細(xì)胞；白細(xì)胞介素-17

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類多發(fā)性硬化(MS)疾病的理想動(dòng)物模型，被廣泛用于研究MS的發(fā)病機(jī)制和治療〔1〕。MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用，能夠直接表征疾病的發(fā)生和發(fā)展〔2〕。IL-17由CD4+T細(xì)胞分泌，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成分泌IL-6和IL-8，在自身免疫性疾病中的重要性受到越來(lái)越多的關(guān)注〔3〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方具有改善MS患者臨床癥狀和降低副反應(yīng)的作用，價(jià)格便宜〔4〕。本研究旨在探討補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方對(duì)EAE大鼠外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞和腦組織IL-17的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物雌性Wistar SPF級(jí)大鼠60只，5～7周齡，體重(182.1±11.3)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22℃、相對(duì)濕度60%～70%、每日光照時(shí)間12 h。補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方為淫羊藿15 g、巴戟天15 g、菟絲子15 g、重樓15 g、六月雪15 g、全蝎10 g、僵蠶15 g、黃芪30 g、澤瀉15 g、川芎20 g、皂刺12 g、莪術(shù)12 g、甘草6 g。依照中藥傳統(tǒng)方法煎煮，制備成0.5 g/ml的溶液，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器及試劑手動(dòng)勻漿機(jī)，購(gòu)自上海玻璃儀器廠；Cr60型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自廣東汕頭醫(yī)用設(shè)備廠；80-1型離心機(jī)，購(gòu)自上海手術(shù)器械廠；XD-202型倒置顯微鏡，購(gòu)自南京江南永新光學(xué)有限公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司。百日咳疫苗原漿液(3.0×1010/ml)，購(gòu)自上海生物制品研究所；完全弗式佐劑，購(gòu)自美國(guó)sigma公司；CD4-FITC(異硫氰酸熒光素)抗體和CD8-PE(藻紅蛋白熒光素)抗體，購(gòu)自天津三箭生物公司；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.3EAE大鼠模型的建立依照相關(guān)文獻(xiàn)〔5，6〕，于Wistar大鼠雙后肢足底處按0.2 ml/100 g劑量皮下注射免疫抗原，在右后肢足背處按0.2 ml/只劑量皮下注射百日咳疫苗原漿液。建模后每日觀察大鼠發(fā)病情況，在大鼠出現(xiàn)食欲不振、體重減輕、精神萎靡、四肢無(wú)力甚至癱瘓等情況，判定EAE模型建立成功。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)措施將60只雌性Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組各12只，空白對(duì)照組：正常Wistar大鼠，未采取任何處理；模型對(duì)照組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予2 ml生理鹽水，持續(xù)14 d；低劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方，15 g/kg，持續(xù)14 d；中劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方，30 g/kg，持續(xù)14 d；高劑量組：建立EAE模型，建模后每天灌胃給予補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方，60 g/kg，持續(xù)14 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)治療結(jié)束后，采集各組大鼠外周血，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平。用免疫組織化學(xué)方法計(jì)數(shù)各組大鼠腦組織切片中的IL-17陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組治療后CD4+、CD8+T細(xì)胞比較與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠CD4+、CD4+/CD8+明顯偏高，CD8+明顯偏低(P<0.05)；與模型對(duì)照組、低劑量組及中劑量組相比，高劑量組大鼠CD4+、CD4+/ CD8+明顯偏低，CD8+明顯偏高(P<0.05)；高劑量組與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組治療后IL-17水平比較治療后，空白對(duì)照組大鼠側(cè)腦室周圍IL-17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(1.41±0.47)個(gè)，模型對(duì)照組為(25.23±7.15)個(gè)，低劑量組為(23.45±9.57)個(gè)，中劑量組為(10.18±4.36)個(gè)，高劑量組為(2.57±1.01)個(gè)。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組明顯偏高(P<0.05)；與模型對(duì)照組、低劑量組相比，中劑量組和高劑量組明顯偏低(P<0.05)；高劑量組與空白對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1　各組治療后CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與高劑量組比較：2)P<0.05

3討論

臨床上對(duì)MS的治療多采用免疫抑制劑或激素療法，病殘率較高，預(yù)后差，價(jià)格高昂〔7〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方對(duì)MS有較好的療效，其不同成分能通過(guò)不同機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的特異細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高患者的機(jī)體免疫力。EAE和人類MS具有相似的免疫、生化、病理和臨床特征，是人類MS疾病的理想動(dòng)物模型。本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方60 g/kg能夠明顯降低EAE大鼠的外周血CD4+T細(xì)胞水平，升高外周血CD8+水平，具有調(diào)節(jié)機(jī)體T淋巴細(xì)胞、改善免疫功能的作用，可改善EAE癥狀。這可能是由于補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方中的藿香對(duì)免疫性炎癥都有一定的抑制作用，而茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，它們從不同方面來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，使機(jī)體免疫功能得到改善〔8〕。有文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕，IL-17的表達(dá)部位主要為炎性細(xì)胞，也有少量表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，IL-17在炎癥反應(yīng)嚴(yán)重的區(qū)域高表達(dá)，而在嚴(yán)重反應(yīng)輕的部位低表達(dá)甚至不表達(dá)。本研究結(jié)果提示補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方30 g/kg、60 g/kg均就能明顯使EAE大鼠腦組織的IL-17水平低表達(dá)。這主要與補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方中的茯苓、澤瀉等成分發(fā)揮的抗感染作用有關(guān)〔10〕。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-08-03修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1298-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.008

基金項(xiàng)目：河南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)中醫(yī)學(xué)科(專科)學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目專項(xiàng)課題(2013ZY03005)；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(2013ZY02012)；鄭紹周全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥人教函〔2012〕149號(hào))

1河南鞏義市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2河南濟(jì)源職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系

第一作者：趙鐸(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療多發(fā)性硬化方面的研究。