李鑫屹　楊　楊　黃校青　曹　宇　李鳳英　賈琳琳　王麗敏　陳潔茹　趙曉蓮　王偉群

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

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白細(xì)胞介素-8對前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移的影響

李鑫屹楊楊1黃校青曹宇2李鳳英賈琳琳王麗敏陳潔茹趙曉蓮?fù)鮽ト?/p>

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究白細(xì)胞介素(IL)-8及其受體在前列腺細(xì)胞系的表達(dá)及IL-8對前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移的影響。方法免疫熒光和Western印跡技術(shù)分別檢測IL-8及其受體在前列腺細(xì)胞系中的表達(dá)；利用CCK8、克隆形成、劃痕實驗檢測IL-8對前列腺癌細(xì)胞生長和遷移的影響。結(jié)果免疫熒光和Western印跡結(jié)果顯示PC-3、DU145和RWPE-1細(xì)胞中都有IL-8及其受體的表達(dá)，PC-3細(xì)胞中IL-8及其受體表達(dá)明顯多于DU145和RWPE-1(P<0.05)；不同濃度的外源性IL-8能促進PC-3細(xì)胞增殖，隨著濃度的增加細(xì)胞增殖效應(yīng)也隨之增加，濃度為80 ng/ml時增殖效果最明顯，但濃度超過80 ng/ml后增殖效果有所下降，濃度為80 ng/ml時與其他組差異顯著(P<0.05)；克隆形成和劃痕實驗結(jié)果顯示80 ng/ml的外源性IL-8能明顯促進PC-3細(xì)胞克隆形成和遷移能力(P<0.01)。結(jié)論IL-8可通過促進前列腺癌細(xì)胞生長、遷移而參與前列腺癌發(fā)生與演進過程。

〔關(guān)鍵詞〕白細(xì)胞介素(IL)-8；前列腺癌；增殖；遷移

西方前列腺癌發(fā)病率和死亡率分別位于男性惡性腫瘤的首位和第二位〔1〕，但目前對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等機制尚不十分明確。白細(xì)胞介素(IL)-8是多效性細(xì)胞因子，也是趨化因子家族中的一員，其在炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究表明，IL-8 也參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔2，3〕。本研究討論IL-8對前列腺癌細(xì)胞生長和遷移的作用。

1 材料與方法

1.1材料RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國)。人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145及永生化前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1(ACTT，美國)，重組人IL-8(Peprotech，美國),兔抗IL-8多克隆抗體(ImmunoWay，美國),兔抗IL-8 R A/B多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，鼠抗β-actin抗體、CY3-羊抗兔IgG(中杉金橋，中國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG(武漢博士德，中國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)PC-3、DU145和RWPE-1細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、 11.1 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青鏈霉素)，細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%按1∶3 傳代。

1.3免疫熒光將培養(yǎng)板中已鋪好細(xì)胞的玻片用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3×3 min；3.7%的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS浸洗3×5 min；0.2% Triton X-100(PBS配制)室溫通透10 min，PBS浸洗3×5 min，吸干PBS；用正常兔血清封閉液室溫封閉45 min，吸去封閉液；滴加兔抗IL-8多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；次日，PBS浸洗玻片3×5 min，吸干玻片上多余液體后滴加CY3-羊抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育30 min，PBS浸洗3×5 min；滴加4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育2 min以進行復(fù)染核，吸去多余的DAPI；滴加抗熒光淬滅劑，封片；激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4Western印跡檢測IL-8受體A和B的表達(dá)胰酶消化10 cm培養(yǎng)皿中長滿的細(xì)胞，并收集細(xì)胞沉淀。加入100 μl蛋白裂解液(含10%蛋白酶抑制劑)，4℃ 1.5 ×104r/min 離心15 min，取上清，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣本經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用β-actin(1∶500)和IL-8受體A/B抗體(1∶200)4℃孵育過夜，Tris-HCl吐溫緩沖液(TBST)洗膜3×5 min，分別加入1∶5 000 辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG，37℃孵育45 min，TBST洗膜4×10 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光，顯影。

1.5增殖實驗將100 μl PC-3細(xì)胞接種于96孔板中(2×103個/孔)，并于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日，加入10 μl不同濃度的IL-8(0，20，40，60，80，100 ng/ml)培養(yǎng)細(xì)胞，每個濃度做6個復(fù)孔，72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，并于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。經(jīng)酶標(biāo)儀測得450 nm處的吸光度值。

1.6克隆形成實驗將1 ml PC-3細(xì)胞鋪入24孔板中(150個/孔)后。將實驗分成2組，每組3孔，對照組加入正常培養(yǎng)基，實驗組加入含IL-8(80 ng/ml)的培養(yǎng)基。每3 d更換相應(yīng)培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)細(xì)胞至12 d。吸去培養(yǎng)基，加入結(jié)晶紫溶液固定、染色細(xì)胞。自來水沖洗后，鏡下計數(shù)并拍照。

1.7劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移將2 ml PC-3細(xì)胞接種于6孔板中后。將實驗分成2組，每組3孔，對照組加入正常培養(yǎng)基，實驗組加入含IL-8(80 ng/ml)的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，用滅菌的移液吸頭在培養(yǎng)板底部劃出一條約1 mm寬的無細(xì)胞區(qū)域，PBS漂洗2次,加入相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，倒置熒光顯微鏡下(×200)觀察細(xì)胞遷移情況。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析，秩和檢驗。

2結(jié)果

2.1免疫熒光實驗結(jié)果IL-8在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145及永生化前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1中均有表達(dá)(圖1)，PC-3最多(0.21±0.03)，RWPE-1最少(0.15±0.01)。PC-3與DU145(0.17±0.01)和RWPE-1差異顯著(P<0.05)。

2.2Western印跡實驗結(jié)果IL-8受體A和B在PC-3、PU145和RWPE-1細(xì)胞中均有表達(dá)。IL-8受體A相對表達(dá)量分別為1.20±0.11、0.92±0.11和0.57±0.07，IL-8受體B分別為0.97±0.16、0.41±0.07和0.42±0.03。PC-3中IL-8受體A和B的表達(dá)量均多于其他兩株細(xì)胞(P<0.01)。在DU145細(xì)胞中，IL-8受體A的表達(dá)量多于RWPE-1細(xì)胞(P<0.05)。見圖2。

圖1　前列腺細(xì)胞株中IL-8的表達(dá)(×400)

圖2　IL-8受體在不同前列腺細(xì)胞株的表達(dá)情況

2.3CCK8實驗結(jié)果72 h后，0、20、40、60、80、100 ng/ml亞組吸光度值分別為0.91±0.10、0.97±0.06、0.98±0.07、1.06±0.06、1.19±0.06和1.10±0.05，與0 ng/ml比較，60、80、100 ng/ml明顯促進PC-3細(xì)胞增殖(P<0.05)。

2.4克隆形成實驗結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)12 d后，對照組和IL-8組克隆數(shù)分別為(27.8±5.67)和(44.6±5.98)，兩者差異顯著(P<0.01)。這表明80 ng/ml的重組人IL-8可促進PC-3細(xì)胞的克隆形成能力，見圖3。

2.5遷移實驗結(jié)果24 h后對照組向劃痕區(qū)域遷移進的細(xì)胞數(shù)量〔(0.37±0.05)mm〕較IL-8組少〔(0.46±0.03)mm,P<0.01〕，見圖4。

圖3　重組人IL-8促進PC-3細(xì)胞的克隆形成能力

圖4　重組人IL-8促進PC-3細(xì)胞的遷移

3討論

前列腺癌已確定的發(fā)病危險因素有年齡、種族和遺傳因子等〔4〕。IL-8是一種促炎性趨化因子，對白細(xì)胞等具有趨化作用〔5〕。研究表明，炎癥因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用〔6〕。它們是腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的重要連接因子。IL-8可與其受體A相結(jié)合，通過G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，可激活下游信號分子，促進腫瘤細(xì)胞的增殖，分化和轉(zhuǎn)移〔7〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族可促使內(nèi)皮細(xì)胞生長及血管生成，從而有助于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用〔8〕。而IL-8可通過影響VEGF的表達(dá)，而加強腫瘤細(xì)胞的侵襲及黏附能力〔9〕。Akiba等〔10〕曾報道，IL-8在肝癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，且與門脈和膽道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。尹華〔3〕采用MTT和劃痕實驗證實施加一定濃度的IL-8 可明顯促進NCI-157細(xì)胞增殖及遷移能力。由此可見，IL-8可參與多種惡性腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生〔11,12〕。本文提示，IL-8的自分泌機制也可能參與前列腺癌的發(fā)生和演進過程。因此，應(yīng)通過基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾正反兩方面技術(shù)來開展IL-8自分泌機制研究，并明確其相關(guān)機制，從而為人類對前列腺癌發(fā)病機制的認(rèn)識提供新的理論依據(jù)，也可為前列腺癌及相關(guān)腫瘤的治療提供新的靶點。

4參考文獻

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〔2015-02-15修回〕

(編輯苑云杰)

The effect of IL-8 on prostate cancer cell proliferation and migration

LI Xin-Qi,YANG Yang,HUANG Xiao-Qing,etal.

Basic Medical College of Jimusi University,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of interleukin(IL)-8 and its receptor in prostate cancer cell lines and the effects of IL-8 on prostate cancer cell proliferation and migration.MethodsThe expression of IL-8 and its receptor were detected by immunofluorescence and Western blot,respectively;the proliferation and immigration were detected by CCK8,clone formation and scratch test.ResultsImmunofluorescence and Western blot showed that PC-3,DU145 and RWPE-1 expressed IL-8 and its receptor,the expression of IL-8 and its receptor in PC-3 cells were more than those of both DU145 and RWPE-1(P<0.05).Different concentrations of IL-8 promoted proliferation of PC-3 cells,and the effect of proliferation increased gradually with the increase of concentration,the effect of proliferation was most obvious when the concentration was 80 ng/ml,however,the effect of proliferation would fall after concentration being more than 80 ng/ml,there was significant difference between 80 ng/ml of group and either of other groups(P<0.05),the results of clone formation and scratches showed that 80 ng/ml of exogenous IL-8 obviously promoted clone formation and migration ability of PC-3 cells(P<0.01).ConclusionsIL-8 can participate in the occurrence and evolution of prostate cancer by promoting the growth and migration of prostate cancer cells.

【Key words】IL-8;Prostate cancer;Proliferation;Migration

〔中圖分類號〕R737

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1294-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.006

通訊作者：王偉群(1974-)，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事腫瘤病理生理學(xué)研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上資助項目(No.81272854)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(No.D201129)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No.201410222036);佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(No.LZR2014-004);佳木斯大學(xué)校長創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(No.xzyf 2014-12)

1佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院

趙曉蓮(1967-)，女，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事泌尿生理學(xué)研究。

第一作者：李鑫屹(1989-)，女，在讀碩士，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤病理生理學(xué)研究。