阮　杰　黃池榮　劉桂平　梁國輝　張　健　劉新光

(廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所，廣東　東莞　523808)

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熒光報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-142-5p的靶基因Becn1

阮杰1,2黃池榮1劉桂平1梁國輝1張健1劉新光1,2

(廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所，廣東東莞523808)

〔摘要〕目的驗(yàn)證miR-142-5p的靶基因——自噬相關(guān)基因Becn1。方法生物信息學(xué)預(yù)測miR-142-5p與Becn1的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的Becn1基因3'UTR野生型和突變型質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與miR-142-5p-mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。結(jié)果miR-142-5p與Becn1的3'UTR存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(123～129)；成功構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒pGL3-Becn1-3'UTR和靶位點(diǎn)含3個(gè)堿基突變的重組質(zhì)粒Mut-3'UTR；與共轉(zhuǎn)染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-NC組相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-142-5p-mimics組熒光素酶活性顯著下降，約為41.2%(P<0.01)；而與對照組相比，共轉(zhuǎn)染Mut-3'UTR和miR-142-5p-mimics組的熒光素酶活性下降不明顯(P>0.05)。結(jié)論初步驗(yàn)證自噬相關(guān)基因Becn1是miR-142-5p的靶基因。

〔關(guān)鍵詞〕miR-142-5p；MicroRNA；Becn1基因；3'非編碼區(qū)(3'UTR)；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒

MicroRNAs(miRNAs)通過識別靶mRNA的3'UTR 區(qū)，降解靶基因或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的〔1,2〕。雙熒光素酶檢測是目前判定miRNA是否與靶基因3'UTR結(jié)合的基本實(shí)驗(yàn)方法。miR-142前體經(jīng)加工可產(chǎn)生成熟的兩個(gè)miRNA，分別為miR-142-5p和miR-142-3p，成熟miR-142-5p的堿基序列為5'-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3'，在物種間具有高度的保守性，在多種腫瘤、免疫相關(guān)疾病和胚胎干細(xì)胞中均發(fā)揮了重要作用〔3〕，并可作為診斷慢性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(CAMR)的生物標(biāo)記〔4〕。近年來研究表明，miR-142-5p與衰老相關(guān)，其在衰老的骨髓源性樹突細(xì)胞(BMDC)中高表達(dá)〔5〕，而在殘粒脂蛋白誘導(dǎo)的衰老人內(nèi)皮祖細(xì)胞〔6〕和衰老過程中人血清中均表達(dá)降低〔7〕。本課題組前期從衰老模型Lmna(核纖層蛋白A/C的編碼基因)缺失型MEFs中篩選出與野生型胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)差異表達(dá)miRNA之一：miR-142-5p。本研究利用熒光報(bào)告系統(tǒng)對miR-142-5p的預(yù)測靶基因Becn1進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料熒光素報(bào)告基因載體(PGL3)雙熒光報(bào)告質(zhì)粒、大腸桿菌(DH5α)與小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)由廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所保存。高保真PrimeStar-Taq酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ購自Takara 公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自Axygen公司。Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測試劑盒購自Promega公司(美國)，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen 公司。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清來源于Gibco 公司，miR-142-5p mimics 及miR-negative control(miR-NC)為上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成，單管型多功能熒光計(jì)為德國Berthold公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1靶基因熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及突變載體構(gòu)建通過TargetScan等網(wǎng)站在線分析miR-142-5p與Becn1的結(jié)合位點(diǎn)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得候選基因Becn1的3'UTR 堿基序列(基因號：NM_019584.3)，通過Premier5.0軟件設(shè)計(jì)Becn1基因3'UTR 區(qū)涵蓋miR-142-5p作用位點(diǎn)的引物及突變引物，見表1。Becn1-3'UTR-PF和Becn1-3'UTR-PR中下劃直線為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ(GAATTC)和XbaⅠ(TCTAGA)，之前序列為保護(hù)堿基，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長度為525 bp；突變引物Becn1-MUT-PF和Becn1-MUT-PR中斜體加下劃波浪線為結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)突變堿基，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1　Becn1基因3′UTR引物

以C2C12細(xì)胞的cDNA為模板，通過PCR法合成Becn1基因3′UTR序列目的片段，經(jīng)內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ雙酶切及純化，并通過T4 DNA 連接酶與線性化的pGL3雙熒光素酶報(bào)告空載體連接，然后將連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，經(jīng)氨芐青霉素篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行(EcoRⅠ/Xba Ⅰ)雙酶切鑒定，并送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，鑒定正確后的質(zhì)粒命名為pGL3-Becn1-3′UTR。

利用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)經(jīng)3輪PCR構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)中含3個(gè)堿基突變的Becn1基因3′UTR突變片段，見圖1。第一輪：以C2C12細(xì)胞的cDNA為模板，Becn1-3′UTR-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，擴(kuò)增Becn1的野生型3′UTR片段。第二輪：以Becn1的野生型3′UTR片段為模板，分別以Becn1-3′UTR-PF和Becn1-MUT-PR、Becn1-MUT-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，擴(kuò)增Becn1的基因片段F1、F2。第三輪：以F1、F2片段為模板，Becn1-3′UTR-PF和Becn1-3′UTR-PR為引物，拼接成Becn1突變的3'UTR基因片段。將Becn1基因突變的3′UTR片段連接到pGL3載體質(zhì)粒構(gòu)建成重組突變載體，經(jīng)雙酶切及送測序鑒定正確后，重組突變載體命名為pGL3-Becn1-mut-3′UTR，簡稱Mut-3′UTR。

XXX為3個(gè)突變堿基圖1　重疊延伸PCR 定點(diǎn)突變Becn1基因3′UTR示意圖

1.2.2雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測分析 37℃ 5%的CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)C2C12細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于48孔板中，每孔總體積250 μl，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，取150 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-142-5p或陰性對照mimics，Becn1基因3'UTR雙熒光報(bào)告基因質(zhì)?；蛲蛔凅w和內(nèi)參pRL-TK，100 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM2000試劑，5 min后三者混合，共250 μl，輕輕搖勻，靜置20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加到細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中。Mimics microRNA轉(zhuǎn)染濃度均為40 nmol/L，pGL3質(zhì)粒濃度為200 ng/孔，內(nèi)參pRL-TK濃度為20 ng/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。6 h后換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后裂解細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)試劑說明書操作，檢測熒光素酶的活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析mmu-miR-142-5p靶基因Targetscan軟件預(yù)測顯示，mmu-miR-142-5p與Becn1基因3'UTR有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(123～129)，針對兩者相結(jié)合位點(diǎn)的靶序列我們設(shè)計(jì)了3個(gè)堿基的突變體，見圖2，命名為Mut1-3'UTR，圖中斜體表示突變位點(diǎn)。

圖2　mmu-miR-142-5p和Becn1 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)(斜體表示突變位點(diǎn))

2.2pGL3-Becn1-3'UTR和Mut-3'UTR重組載體的構(gòu)建及鑒定將PCR合成的Becn1基因野生型和突變型3'UTR序列分別構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體pGL3中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ/XbaⅠ)鑒定，見圖3，結(jié)果顯示pGL3-Becn1-3'UTR和Mut-3'UTR重組載體雙酶切均可見大小兩條帶，大片段與pGL3空載體片段(5 258 bp)等大小，小片段(525 bp)分別與PCR擴(kuò)增的Becn1基因野生型或突變型3'UTR片段相符。

將重組載體送測序結(jié)果顯示：pGL3-Becn1-3′UTR重組載體的Becn1-3'UTR 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫所提供的序列相同(見圖4A)。Mut-3'UTR突變體3'UTR片段插入方向正確，結(jié)合位點(diǎn)3個(gè)堿基TTT定點(diǎn)突變?yōu)镚GC，與理論相符，其余序列均與GenBank中Becn1的3'UTR序列一致(見圖4B)。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Becn1基因3'UTR野生型熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Becn1-3'UTR及突變載體Mut-3'UTR。

M：Trans2K plus ⅡDNA Marker；1：pGL3-Becn1-3'UTR雙酶切產(chǎn)物；2：Mut-3'UTR雙酶切產(chǎn)物；3：pGL3空載質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；4：pGL3-Becn1-3'UTR質(zhì)粒PCR產(chǎn)物；5：Mut-3'UTR質(zhì)粒PCR產(chǎn)物圖3　重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

圖4　重組質(zhì)粒測序結(jié)果部分圖譜

2.3轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞熒光素酶表達(dá)的檢測結(jié)果將構(gòu)建好的野生型pGL3-Becn1-3′UTR重組質(zhì)粒和靶位點(diǎn)突變型Mut-3'UTR重組質(zhì)粒分別與miR-142-5p-mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞，檢測熒光素酶活性。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示：與共轉(zhuǎn)染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-NC組相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-Becn1-3'UTR和miR-142-5p-mimics組熒光素酶活性顯著下降，約為41.2%(P<0.01)，而與對照組相比，共轉(zhuǎn)染Mut-3'UTR和miR-142-5p-mimics組的熒光素酶活性下降不明顯(P>0.05)。

3討論

miRNA是一種長度約22個(gè)核苷酸左右的非編碼小分子RNA，是潛在的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在大多數(shù)生理病理過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，其中包括衰老〔1〕。本研究中的miR-142-5p是從衰老模型Lmna(核纖層蛋白A/C的編碼基因)缺失型和野生型MEFs中篩選出來的差異表達(dá)miRNA之一。Lmna基因具有突變位點(diǎn)較多的特點(diǎn)，且同一基因由于不同位點(diǎn)的突變可產(chǎn)生衰老、肌肉營養(yǎng)不良等十多種不同的疾病〔8〕。核纖層蛋白A/C缺失導(dǎo)致人胚肺成纖維細(xì)胞IMR-90生長停滯及衰老相關(guān)的標(biāo)記增加，如β-半乳糖苷酶染色的藍(lán)染衰老細(xì)胞增多，CDK抑制劑p21和核小體PML表達(dá)增加〔9，10〕。研究表明，miR-142-5p可通過作用并下調(diào)靶基因B細(xì)胞易位基因3(BTG3)，誘導(dǎo)cyclin D1、cyclin D3、E2F3 等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖〔11〕。Ding等〔3〕在研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p和miR-142-3p可分別作用于靶基因CD84和SAP，并調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞及B細(xì)胞活性，從而調(diào)節(jié)自身免疫。但miR-142-5p在衰老中的作用機(jī)制尚缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

通過TargetScan、miRDB、miRanda及Clip-seq四種數(shù)據(jù)庫對mmu-miR-142-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，自噬相關(guān)基因Beclin1(Becn1)是本實(shí)驗(yàn)感興趣的候選靶基因，其3'UTR與miR-142-5p存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(123～129)，且兩者的相關(guān)性較高。Becn1基因位于人染色體17q21，與酵母atg6 /vps30同源，是重要的哺乳動物自噬特異性基因，其編碼的自噬蛋白Becn1是一個(gè)60 kD卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白〔12，13〕，有BH3、CCD和ECD三個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，與PI3KⅢ/Vps34、Bcl-2蛋白家族、UVRAG結(jié)合形成復(fù)合體，發(fā)揮多種生物學(xué)作用，在胚胎形成、調(diào)節(jié)自噬活性、腫瘤抑制等方面發(fā)揮重要作用〔14〕。研究表明自噬與衰老有很大關(guān)系，衰老時(shí)細(xì)胞自噬降解效率下降及細(xì)胞內(nèi)廢物積累〔15〕。Becn1參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和炎癥小體激活，對衰老過程有重要影響。如基因毒性、代謝和環(huán)境損害等衰老相關(guān)因素，可增強(qiáng)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB驅(qū)動的抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)，使Becn1依賴的自噬受到抑制，從而增強(qiáng)衰老、引發(fā)腫瘤或細(xì)胞衰老〔16〕。也有研究表明Becn1對人類黃體細(xì)胞和卵巢雄激素分泌細(xì)胞的壽命有重要調(diào)節(jié)作用，維持自噬水平有利于黃體和卵巢雄激素分泌細(xì)胞的存活〔17〕。

綜上本文初步驗(yàn)證了miR-142-5p靶作用于自噬相關(guān)基因Becn1，為進(jìn)一步探討miR-142-5p及其靶基因Becn1在核纖層蛋白病模型Lmna缺失小鼠中發(fā)揮的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R34

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1284-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.002

通訊作者：劉新光(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事衰老與衰老相關(guān)疾病機(jī)制的研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81170327)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(No.A2014470)；東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目與醫(yī)療衛(wèi)生一般項(xiàng)目(No.2012108102022，201410515200159)；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目(No.XK1412,ZZDC006,ZZDC009,STIF201102)

1廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院2廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：阮杰(1972-)，女，博士，副教授，主要從事miRNA與衰老相關(guān)疾病機(jī)制的研究。