喬寶軍李世榮武子濤李愛琴康倩何玉琦桂紅珍盛劍秋

(第三軍醫(yī)大學研究生院，重慶　400038)

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納米葉酸磁珠靶向檢測技術在老年結直腸癌患者早期診斷中的應用

喬寶軍李世榮武子濤李愛琴康倩何玉琦桂紅珍盛劍秋1

(第三軍醫(yī)大學研究生院，重慶400038)

〔摘要〕目的探討納米葉酸磁珠靶向檢測技術在老年結直腸癌患者早期診斷中的應用。方法經腸鏡活檢確診的早期結直腸癌老年患者115例，隨機分為兩組，即A組-新型清腸液收集裝置檢測，63例；B組-新型清腸液收集裝置結合納米葉酸磁珠檢測，52例。收集患者自然糞便和結腸鏡檢前的清腸液；轉鐵蛋白檢測法檢測糞便中的轉鐵蛋白；應用常規(guī)方法和納米葉酸磁珠檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌。結果A、B兩組自然糞便中便隱血試驗陽性人數(shù)均較清腸液低(P均<0.05)；A、B兩組自然糞便中通過檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌的陽性人數(shù)較清腸液低(P均<0.05)；使用納米葉酸磁珠靶向檢測技術的陽性率在兩組中都比使用傳統(tǒng)檢測技術高(P均<0.05)。結論納米葉酸磁珠靶向檢測技術在老年結直腸癌患者早期診斷中的應用效果非常顯著，可能是對結直腸癌進行早期篩查和診斷的良好方法。

〔關鍵詞〕納米技術；葉酸受體；結直腸癌；靶向檢測

結直腸癌一直是中國人最為常見的惡性腫瘤之一〔1，2〕，高發(fā)生率，而且早期的臨床表現(xiàn)不顯著。葉酸受體(FR)的亞型FRα有抗原性及受體，故可介導細胞內反應的作用，其可用在腫瘤診斷和靶向治療領域〔3，4〕。由于FRα的表達與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系〔5~7〕，本研究探究納米技術在FR介導的老年早期結直腸癌患者細胞靶向檢測中的應用。

1資料與方法

1.1一般資料2013年5月至2014年12月我院經腸鏡活檢確診的早期Ⅰ~Ⅱ期結直腸腺癌的老年患者115例。均經腸鏡活檢確診的早期結直腸癌。排除標準：①各型病毒性肝炎的患者；②自身免疫性疾病的患者；③其他惡性腫瘤患者；④糖尿病患者；⑤嚴重的心血管疾病患者；⑥嚴重的腦血管疾病患者；⑦腎功能損害患者；⑧嚴重肺氣腫患者；⑨房顫等嚴重心律失?；颊?；⑩各種精神疾病患者。失聯(lián)預計原因：①中途退出試驗；②試驗過程中轉院治療；應對措施：按照1∶1比例相應補充受試患者。倫理學考量：①患者及其直系家屬在充分了解研究的過程的基礎之上簽署參與該臨床研究的知情同意書；②納入患者相關診治和監(jiān)護措施均以臨床指南相關原則為依據，對患者的醫(yī)療治療和安全有充分保障。③對納入患者的信息及診療記錄予以保密，保護患者的隱私權。④在中國臨床試驗注冊中心注冊試驗方案，試驗中遵循《渥太華工作組關于臨床試驗注冊的聲明》。

1.2分組按照計算器隨機數(shù)字法隨機分為兩組，即A組63例，男33例，女30例，平均年齡(68.31±8.02)歲。B組52例，男28例，女24例，平均年齡(67.25±6.43)歲。兩組年齡、性別比、腫瘤分期和腫瘤分型均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。A組：新型清腸液收集裝置收集患者的自然糞便和清腸液后常規(guī)檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌；B組：新型清腸液收集裝置收集患者的自然糞便和清腸液后應用納米葉酸磁珠檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌。

1.3儀器與試劑免疫糞便隱血試劑盒(消康保)；糞便轉鐵蛋白檢測試劑盒(訴而準)。以上二者均為膠體金法。購自北京萬華普蔓生物工程有限公司。BCD826型排便清腸器(江蘇立刻通公司)。納米葉酸磁珠檢測試劑盒(北京化工大學提供)。細胞保存液(又叫液基細胞保存液)；北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心生產。5 ml塑料吸管，15 ml、50 ml尖底離心管購自江蘇海門儀器廠。離心機購自北京醫(yī)用離心機廠。自動細胞制片機及其附屬設備購自浙江寧波美生醫(yī)療器械有限公司。光學顯微鏡為 Olympus BX-50型。換氣消毒工作臺購自北京京東醫(yī)療儀器有限公司。微量振蕩器XK96-4E型由江蘇新康醫(yī)療器械有限責任公司設計制造。

1.4檢測方法(1)便隱血試驗(FOBT)〔8〕操作步驟：按照說明逐步進行。(2)新型清腸液收集裝置收集患者清腸液：①留患者結腸鏡檢前排出的第4次清腸液；②裝入廣口瓶里面；③20℃放置置0.5 h；④棄上清；⑤取30 ml置入收集瓶里面；⑥加入細胞的保存液；⑦充分搖勻；⑧送檢(2 h之內)；⑨提取脫落細胞。(3)常規(guī)法行糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌篩查：操作步驟：①取患者自然糞便和清腸液50~100 ml；②加入100 ml MEM細胞營養(yǎng)液；③攪拌混合；④經孔徑600 μm篩網過濾，濾液中加入過飽和量的硼酸以溶解糞便中的黏液，攪拌使硼酸充分溶解；⑤依次經孔徑150 μm和76 μm篩網過濾；⑥1 500 r/min，室溫離心10 min；⑦棄去上清，5 ml生理鹽水進行重懸；⑧重懸液與20 ml 95%乙醇混勻；⑨過濾(篩網孔徑50 μm)，1 500 r/min，20℃離心10 min；⑩棄上清，取沉淀涂片，涂片經95%的乙醇固定15 min，HE染色，光鏡下觀察。(4)應用納米葉酸磁珠檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌：①將患者自然糞便和清腸液加細胞保存液至50 ml；②用吸管吹打再次充分混勻；③過濾(篩網孔徑600 μm)；④棄濾渣，20℃離心10 min(轉速：1 200 r/min)；⑤棄上清，保留沉淀物；⑥加10 ml保存液和40 μl含磁珠的懸液混勻，37℃孵育45 min；⑦將裝有混懸液的離心管與磁鐵貼壁反應15 min，將上清液移入另一15 ml尖底離心管；⑧用2 ml液基保存液沖洗貼壁磁珠-細胞結合物，吹打，離心10 min，1 000 r/min；⑨磁珠和細胞的懸液1 ml及上清液1 ml置液基的薄層型制片夾，20℃離心4 min，1 000 r/min；⑩細胞涂片，使用95%乙醇進行固定10 min后HE染色。

1.5觀察指標①FOBT陽性率；②通過檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌的檢出率。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2結果

2.1FOBT陽性率A組便隱血試驗陽性52例，清腸液陽性59例；B組便隱血試驗陽性46例，清腸液陽性50例。A、B兩組自然糞便中便隱血試驗陽性人數(shù)均較清腸液低(P均<0.05)。

2.2通過檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌的檢出率A、B兩組自然糞便中通過傳統(tǒng)方法檢驗糞便脫落細胞篩查早期結直腸癌的陽性人數(shù)49、49例，較清腸液56、52例低(P均<0.05)；B組較A組檢出率明顯高(P均<0.05)。見圖1。

圖1　兩組脫落細胞篩查早期結直腸癌的檢出比較(×20)

3討論

葉酸及修飾有葉酸的納米級磁性材料(FA)亦稱碟谷酰胺〔9〕。該維生素的結構是由碟酸與谷氨酸兩種物質脫水以后形成的復合體。因為FR主要識別碟酸，故而碟谷酰胺常常通過谷氨酸的羧基端和其他生物材料相連之后再與FR相互結合。FR是一種富含半胱氨酸的糖蛋白，有三種常見的異構體，即包括有FRα和FRβ及FRγ〔10，11〕，其可以通過糖基化的磷脂酰肌醇連接于各種細胞的胞膜表面。FR的亞型中的FRα在正常組織之中的表達水平非常低，然而在腫瘤組織之中的表達則很高。如果采用超出生理劑量的葉酸制劑加入離體培養(yǎng)的腫瘤細胞懸液之中會誘發(fā)腫瘤細胞的加速增殖，而且癌組織內FR水平的上調也會導致癌組織的生長加快和葉酸的堆積。這一系列的研究發(fā)現(xiàn)為FR應用于腫瘤細胞的靶向檢測奠定基礎〔12~14〕。較之其他生物材料，碟谷酰胺在生物材料修飾中有其獨特的優(yōu)勢。FR碟谷酰胺不但價格低廉且容易獲得，其性質尤其穩(wěn)定，而且儲存非常方便。此外，F(xiàn)R在人體多種腫瘤中均高表達，故而適用的腫瘤類型極其廣泛。因為碟谷酰胺是人體內必需的維生素〔15，16〕，故而其免疫原性很低。碟谷酰胺無任何毒性，其和FR的親和力非常高。此外，碟谷酰胺的分子很小而且滲透非?？?，故而碟谷酰胺能夠通過FR誘導的細胞膜內吞作用進入各種細胞之內，這一特性非常便于碟谷酰胺作為運載物在細胞中被人體攝取。此外，碟谷酰胺還能夠和其他生物材料發(fā)生定向性耦聯(lián)并其長時間保持生物活性。

磁性納米材料直徑在1~100 nm〔17，18〕，是一種具有非常獨特的磁性效應、量子尺寸效應、小尺寸效應、比表面積效應和宏觀量子隧道效應等等特殊效應的納米級別的粒子，故而具有非常獨特的技術優(yōu)勢：①這種材料的尺寸非常??；②該納米材料能夠自由地滲透進入血管內；③該納米材料在外磁場的作用之下可以產生磁性，繼而發(fā)生聚集；④該納米材料可以隨著磁場的變化而發(fā)生熱效應；⑤該納米材料能夠按照不同的使用目的而進行各種人工修飾，以期增加其生物的相容性和診療的靶向性。通過碟谷酰胺的α羧基端或者γ羧基端能夠與具備氨基的磁性納米級生物材料形成酰胺鍵。因為腫瘤組織的血管異常豐富而且其內部結構性很差，故而耦聯(lián)碟谷酰胺后的磁性級納米生物材料不但能夠通過腫瘤組織表面特有的高滯留效應來滲透和富集在腫瘤組織之中，還能夠通過外加磁場的作用使耦聯(lián)的生物材料高度富集在腫瘤組織周圍區(qū)域。如此，結合FR從而主動靶向進入腫瘤細胞的碟谷酰胺修飾的磁性納米材料成為腫瘤的檢測和靶向治療的理想選擇。本研究提示，F(xiàn)R對于葉酸及葉酸類似物均有非常高的親和特異性，可介導這些物質內吞進入細胞。外源性的葉酸復合物與細胞膜表面的FR特異性結合，周圍形成凹陷，進入細胞內形成內涵體。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R604

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1134-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.052

通訊作者：盛劍秋(1958-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事大腸癌的診斷與治療研究。

基金項目：上海交通大學基金課題(SS2014AA020803)

1北京軍區(qū)總醫(yī)院消化內科

第一作者：喬寶軍(1976-)，男，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事大腸癌的診斷與治療研究。