徐　璇　于世鵬　劉　杰

(山東大學(xué)，山東　濟(jì)南　250100)

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三葉因子3與生長分化因子-15在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達(dá)及意義

徐璇于世鵬1劉杰

(山東大學(xué)，山東濟(jì)南250100)

〔摘要〕目的探討三葉因子3(TFF3)及生長分化因子-15(GDF-15)在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法分別檢測甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、甲狀腺濾泡性腺瘤(FA)及正常甲狀腺(NT)組織中(各30例)TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達(dá)。結(jié)果正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA的表達(dá)量明顯高于甲狀腺濾泡狀癌及FA(P<0.01)，而FA中的TFF3 mRNA的表達(dá)量明顯高于甲狀腺濾泡狀癌(P<0.05)。甲狀腺濾泡狀癌及FA中GDF-15 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常甲狀腺組織(P<0.01)，而甲狀腺濾泡狀癌中的GDF-15 mRNA的表達(dá)量明顯高于FA(P<0.01)。結(jié)論TFF3 mRNA的低表達(dá)和GDF-15 mRNA高表達(dá)可能與甲狀腺濾泡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，對進(jìn)一步區(qū)分甲狀腺濾泡性腫瘤良惡性，提高診斷準(zhǔn)確率有重要意義。

〔關(guān)鍵詞〕甲狀腺濾泡狀癌；甲狀腺濾泡性腺瘤；三葉因子3；生長分化因子-15；RT-PCR

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢〔1〕，因而甲狀腺惡性腫瘤的確切發(fā)病機(jī)制及如何快速、有效地鑒別甲狀腺良惡性腫瘤已成為目前研究的熱點(diǎn)。目前甲狀腺細(xì)針抽吸活檢細(xì)胞學(xué)檢查(FNAB)被認(rèn)為是術(shù)前評估甲狀腺腫瘤良惡性的最好診斷工具，但是對于臨床甲狀腺病理中最難鑒別的濾泡性腫瘤，細(xì)胞學(xué)檢查并不能明確診斷，因而發(fā)掘靈敏度高、特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物成為諸多學(xué)者努力的方向。三葉因子(TFF)3為近年來研究較多的一種小分子多肽，其通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等過程促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。生長分化因子(GDF)-15是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族中的一員，參與組織胚胎發(fā)育、細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)調(diào)控、炎癥反應(yīng)及急性損傷修復(fù)等生理病理過程，并對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)或抑制作用。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法分別檢測甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺濾泡性腺瘤(FA)及正常甲狀腺組織(甲狀腺濾泡性腺瘤周邊正常甲狀腺組織)中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達(dá)，探討其與甲狀腺濾泡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及對甲狀腺濾泡性腫瘤良惡性的鑒別意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源從2011年9月1日至2013年7月6日在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院乳甲外科行手術(shù)治療的甲狀腺濾泡狀癌、FA患者中隨機(jī)選取各30例。所有研究對象均經(jīng)過濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，并與患者及家屬簽署書面知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受放化療、內(nèi)分泌治療及其他免疫治療；RT-PCR標(biāo)本均于手術(shù)切除后0.5 h內(nèi)采集，迅速置于液氮中保存，0.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫袠?biāo)本病理類型在術(shù)后均經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理科專家證實(shí)。

1.2方法RT-PCR法測定甲狀腺濾泡性腫瘤及正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達(dá)。首先應(yīng)用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取100 mg甲狀腺組織中的總RNA。紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度，波長280 nm與260 nm讀取的吸光度比值在1.8~2.0，表明提取的RNA無明顯降解，質(zhì)量較好，用作RT-PCR模板。然后取5 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，收集cDNA，用PCR法擴(kuò)增目的片段，引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成。引物序列TFF3正義鏈：GACAGTTCTTCGTGCCTGAGA，反義鏈：GAGTCTTTTCCTGCCCTTGAG；GDF-15正義鏈：AAGAACTCAGGACGGTGAATG，反義鏈：CCGCAACTCTCGGAATCTG。RT-PCR反應(yīng)體系：在PCR專用管中依次加入cDNA 2 μl、正義鏈引物2 μl、反義鏈引物2 μl、Supermix 44 μl，共計(jì)50 μl，離心半徑8.25 cm、1 200 r/min，離心35 min混勻。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 2 min進(jìn)入循環(huán)，變性94℃ 30 s，退火TFF3 57℃/GDF-15 55℃ 30 s，復(fù)性72℃ 30 s，TFF3 35/GDF-15 32個(gè)循環(huán)，(β-actin 25個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min延伸)，取PCR產(chǎn)物(12.5+2.5)μl DNA上樣緩沖液在3%瓊脂糖凝膠上電泳，拍照后分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用SPSS13.0軟件對兩組間比較用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)(U-Mann-Whitney檢驗(yàn))，多組間比較行多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

見表1、圖1。甲狀腺濾泡狀癌、FA及正常組織中均可檢測到TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達(dá)。正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA的表達(dá)量高于甲狀腺濾泡狀癌(Z=-4.668，P=0.000)和FA(Z=-3.320，P=0.001)，而FA中TFF3 mRNA的表達(dá)量高于甲狀腺濾泡狀癌(Z=-2.522，P=0.0125)。甲狀腺濾泡狀癌(Z=-4.062，P=0.000)和FA(Z=-2.915，P=0.004)中GDF-15 mRNA的表達(dá)量高于正常甲狀腺組織，而甲狀腺濾泡狀癌中GDF-15 mRNA的表達(dá)量高于FA(Z=-2.916，P=0.004)。

表1　不同甲狀腺組織中TFF3 mRNA及

與正常甲狀腺組織比較:1)P<0.01；與FA組織比較:2)P<0.05，3)P<0.01

1~3：正常甲狀腺組織；甲狀腺濾泡狀癌組織；FA組織圖1　RT-PCR分析TFF3、GDF-15在不同甲狀腺組織中的表達(dá)

3討論

我國人群中甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率約為20%~76%，其中又有5%~15%為惡性〔1〕。臨床上可通過病史詢問、觸診、影像學(xué)檢查、細(xì)針抽吸活檢等方法來評估其良惡性。但是對于甲狀腺濾泡性腫瘤，術(shù)前診斷率不高，通常術(shù)后性組織病理學(xué)才能確診。近年來現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，為我們研究其發(fā)病機(jī)制提供了技術(shù)支持，同時(shí)也為找到可靠腫瘤標(biāo)記物打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。因而，通過分子生物技術(shù)研究甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制及找出靈敏度和特異性兼?zhèn)涞哪[瘤標(biāo)記物成為許多學(xué)者奮斗的目標(biāo)。

人的TFF3基因定位于21q22.3區(qū)域，TFF3分子由59個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)P結(jié)構(gòu)域，其羧基端含有第7個(gè)半胱氨酸殘基，有利于形成同源二聚體與其他蛋白分子相互作用〔2，3〕。TFF3主要在小腸和結(jié)腸的杯狀細(xì)胞，胃竇黏膜中高表達(dá)〔4〕，對黏膜的再生和修復(fù)起非常重要的作用，此外它還參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生等過程。目前認(rèn)為TFF3抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制主要有以下途徑：① 降低MAPK/ERK的磷酸化，減少細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)致細(xì)胞及其核內(nèi)，從而抑制細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生物學(xué)反應(yīng)〔5〕；② 增加細(xì)胞周期激酶抑制劑p16INK4和p21CIP1/Waf1水平，兩者分別與不同的細(xì)胞周期素結(jié)合，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖；③ 抑制 cyclinD1/cdk4 和cyclinE/cdk2 復(fù)合物的活性，從而阻止細(xì)胞周期中S期的啟動，使細(xì)胞靜止在G1期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖〔6〕等。生長分化因子-15是1997年Bootcov等〔7〕從激活的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的TGF-β 超家族的成員，基因定位于19p13.1-13.2，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。生理情況下，GDF-15只在胎盤及前列腺等少數(shù)組織大量表達(dá)，當(dāng)機(jī)體荷瘤時(shí)，可檢測出GDF-15表達(dá)增加。多項(xiàng)研究表明，GDF-15在前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、顱內(nèi)腦瘤、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤的細(xì)胞、血清或腦脊液中表達(dá)升高〔8〕。GDF-15可通過以下方面促進(jìn)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展：①激活胞內(nèi)TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體及Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白復(fù)合體，使其作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA的信號識別序列CAGAC結(jié)合，從而調(diào)控細(xì)胞增殖〔9〕；②激活細(xì)胞內(nèi)信號分子，如Ras/MAPKs、PI3K/Akt/mTOR信號途徑〔10〕，Ras激活后，導(dǎo)致GTPase活性下降，使Ras保持持續(xù)活化狀態(tài)，從而激活下游MAPK級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞大量增殖而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化〔11〕，GDF-15可能為PI3K/Akt/mTOR通路的一個(gè)上游靶基因，其能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號途徑通路阻止細(xì)胞凋亡〔12〕；③抑制樹突細(xì)胞的成熟，使T細(xì)胞增殖活化為效應(yīng)T細(xì)胞過程中的協(xié)同刺激分子水平降低，抑制了T細(xì)胞的活化，使細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)減弱，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸〔13〕。

本研究提示TFF3 mRNA在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達(dá)有一定的特異性，其可能參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。其在良惡性不同的甲狀腺濾泡性腫瘤中表達(dá)不同，提示TFF3 mRNA對甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性的鑒別具有重要參考價(jià)值。其在甲狀腺濾泡狀癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，提示TFF3可能在甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到保護(hù)機(jī)體的作用。這與Krause等〔14〕、Karger等〔15〕、Takano等〔16〕和Patel等〔17〕的觀點(diǎn)一致。GDF-15 mRNA在正常甲狀腺、FA、甲狀腺濾泡狀癌組織中均有表達(dá)，并且其表達(dá)量依次升高，提示GDF-15 mRNA同樣也參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。其在良惡性不同的甲狀腺濾泡性腫瘤中表達(dá)也不同，提示GDF-15亦對甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性的鑒別具有重要參考價(jià)值。然而GDF-15 mRNA在甲狀腺濾泡狀癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，提示GDF-15可能對甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用，并且可能為甲狀腺濾泡狀癌病情進(jìn)展、惡性轉(zhuǎn)移的重要信號。這與Krause等〔14〕和Weber等〔12〕觀點(diǎn)一致。并且Krause等〔14〕研究證實(shí)聯(lián)合檢測以上兩種分子在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達(dá)可能對其良惡性的鑒別更具參考價(jià)值。但是，TFF3與GDF-15具體通過何種途徑影響甲狀腺濾泡狀癌發(fā)生發(fā)展，仍需大樣本量的臨床資料統(tǒng)計(jì)分析及更深層次的實(shí)驗(yàn)室研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為，TFF3和GDF-15參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，TFF3可能在此過程中起抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，而GDF-15可能對其發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用，其核酸水平的檢測可為鑒別甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性提供參考依據(jù)，這與國外使用不同方法(cDNA arrays，SAGE，adapter-tagged competitive PCR)所得到的研究結(jié)果一致〔12，16，18，19〕。因此，推測應(yīng)用檢測TFF3 mRNA和GDF-15 mRNA表達(dá)來輔助識別甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性，對甲狀腺濾泡性腫瘤的術(shù)前診斷具有重要參考價(jià)值。

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〔2014-09-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R581.9

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1130-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.050

通訊作者：于世鵬(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事甲狀腺疾病研究。

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

第一作者：徐璇(1988-)，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌與代謝病的研究。