劉　珂　阮林海

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院血液科，河南　洛陽　471003)

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間充質(zhì)干細胞對老年慢性粒細胞白血病患者免疫調(diào)節(jié)功能的影響

劉珂阮林海

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院血液科，河南洛陽471003)

〔摘要〕目的分析老年慢性粒細胞白血病(CML)骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSC)的免疫調(diào)節(jié)功能。方法老年CML患者15例，同時選取正常人來源的MSC 12例，評估T細胞的免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果兩組細胞的形態(tài)與免疫表型差異不明顯，相對正常人，CML骨髓來源的MSC對T細胞增殖有減輕抑制作用，而對抑制T細胞的凋亡具有促進作用。在正常對照的MSC與PHA 刺激的單核細胞比例為1∶3時，可抑制T細胞增殖5%以下，而當CML骨髓來源的MSC與PHA 刺激的單核細胞培養(yǎng)時，可抑制T細胞增殖比例為45%；CML骨髓來源的MSC與T細胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)凋亡率上升明顯，CD25、CD44、CD29凋亡率各自達到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，對比正常人來源的MSC與經(jīng)PHA誘發(fā)的T細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CD25、CD44、CD29綜合凋亡率為(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%。結(jié)論老年CML患者進行移植時應(yīng)選用正常人干細胞,有利于保護血液系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能。

〔關(guān)鍵詞〕間充質(zhì)干細胞；慢性粒細胞白血病；免疫調(diào)節(jié)

白血病是臨床常見的惡性血液病，常造成患者貧血、全身感染導致死亡〔1〕。而其中以慢性粒細胞白血病(CML)最為嚴重，對體內(nèi)造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)損傷最明顯。造血干細胞可產(chǎn)生一系列血液因子，而傳統(tǒng)觀點認為間充質(zhì)干細胞僅能刺激紅細胞和白細胞系的產(chǎn)生，從而忽略了細胞自身功能〔2〕。間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能不僅在血液系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，同時其免疫調(diào)節(jié)作用也有利于疾病的治療。這種免疫調(diào)節(jié)作用可損害正常T細胞的生理代謝及作用發(fā)揮，T細胞數(shù)量減少，最終組織的功能減退，出現(xiàn)一系列免疫系統(tǒng)疾病〔3,4〕。本文對比正常人與老年CML患者骨髓的MSC的免疫調(diào)節(jié)功能。

1資料與方法

1.1一般資料2011年3月至2013年10月我院老年CML患者，男9例，女6例；年齡61~77歲，平均(66.2±2.3)歲。患者之間的年齡、職業(yè)、病史、住院時間均無明顯差異(P>0.05)。診斷均符合臨床通用的CML診斷標準〔5〕，且經(jīng)實驗室檢查確診，排除易引起混淆的其他疾病如淋巴瘤、小細胞性貧血、脾功能亢進等。再隨機選取正常人12例，其中男7例，女5例，年齡60~75歲，平均(64.8±2.7)歲。

1.2MSC培養(yǎng)在無菌環(huán)境中采集骨髓10~20 ml置于事先清洗的試管中，隨后轉(zhuǎn)移至放入細胞分離液及稀釋劑的離心管內(nèi)，比例控制在1∶2。混勻后置于勻速離心機中進行旋轉(zhuǎn)，設(shè)定2 000 r/min的轉(zhuǎn)速，時間為30 min〔6〕。隨后在白膜層進行試管的吸取，最終得出單個細胞，選用細胞培養(yǎng)液洗滌后進行計數(shù)及分類處理，在培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，生長過程中密切觀察形態(tài)，定期清理培養(yǎng)中懸浮物及更換培養(yǎng)液。最終待細胞融合后收集干細胞，進行低溫貯存。

1.3免疫熒光法進行細胞免疫表型的測定收集完成的MSC進行分離后，充分洗滌以保證成分的唯一性，采用流式細胞儀中免疫熒光法測定。其中細胞內(nèi)抗原Flk-1需要破壞細胞膜，故取適量細胞加入10%甲醛水溶液5℃下進行處理，最后使用Flk-1單克隆抗體進行檢測；而其他細胞因子包括CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR等，僅需分離純化后加入相應(yīng)單克隆抗體進行逐一檢測〔7〕。最終將細胞貯存于低溫環(huán)境中。

1.4MSC對T細胞增殖的影響對于正常人及MSC患者的外周血進行培養(yǎng)，采用離心法進行單個細胞的分離，放入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h后獲取上層細胞，放入含RPMI1640培養(yǎng)基的中性細胞孔，每組培養(yǎng)3孔以保證準確性，保證在10%CO2且濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)，3 d后進行觀察。隨后按照研究順序分為4組實驗：①空白對照組：僅加入T細胞而不加入細胞刺激因子；②反應(yīng)對照組：加入T細胞后，同時加入刺激因子；③正常組：加入正常人MSC，保證MSC與T細胞比例在1∶10；④CML組：加入CML患者的MSC。培養(yǎng)完畢后加入35×103的3H-Tdr(來源于北京市放射與核醫(yī)學研究所)進行計數(shù)，取各孔之間的平均數(shù)作為最終結(jié)果〔8〕。

1.5混合淋巴細胞反應(yīng)刺激性T細胞與T細胞進行誘發(fā)性混合淋巴反應(yīng)時，可分為4組進行研究：①空白對照組：反應(yīng)過程中不加入刺激性T細胞而僅加入T細胞；②反應(yīng)對照組：反應(yīng)中加入T細胞，同時加入刺激性T細胞作為激發(fā)因子；③正常組：在T細胞及刺激性T細胞的基礎(chǔ)上額外加入正常人的MSC，其中MSC與T細胞的比例維持在1∶10以起到最佳反應(yīng)效果；④CML組：在T細胞及刺激性T細胞的基礎(chǔ)上額外加入CML患者的MSC，其中MSC與T細胞的比例依然為1∶10。檢測方法相同，觀察反應(yīng)結(jié)果〔9〕。

1.6MSC對T細胞周期的影響正常MSC與T細胞保持1∶10的比例時抑制作用最明顯，故研究中始終維持此比例。采用加入3T3細胞組進行對比，各組均加入刺激因子，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后采集反應(yīng)細胞，采用無水酒精浸泡1 h以進行細胞固定，隨后選用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，染色后選用細胞儀進行細胞周期分析，運用冷凍法保證細胞周期計數(shù)的準確性。細胞周期定義為從一次分裂結(jié)束后到下一次分裂結(jié)束為止，注意區(qū)分細胞分裂的間期與分裂期，計數(shù)應(yīng)準確。若同一細胞存在不同結(jié)果時，以合理范圍內(nèi)細胞周期相對較長者為最終結(jié)果。

1.7MSC對T細胞活化的影響按照前述的細胞培養(yǎng)方法進行細胞培養(yǎng)，分離出單個核的細胞，加入細胞刺激因子進行獨立培養(yǎng)，其后分別混合正常人和CML、MSC進行共同培養(yǎng)，維持1∶10的研究比例，T細胞活性指標選用細胞儀監(jiān)測所得的細胞因子表達指標，且不同細胞因子進行不同時間的觀察。24 h內(nèi)進行CD28的觀測，48 h進行CD45的觀測，最終7 d后進行CD72的表達測定，從多細胞因子的共同效應(yīng)反映活化情況。

1.8MSC對T細胞凋亡的影響凋亡的檢測采取Amanex計數(shù)法，在200 ml細胞懸液中均勻加入細胞并進行凋亡細胞的計數(shù)。選用前述方法進行正常人和CML培養(yǎng)并進行單個核的分離，加入細胞刺激因子后進行單獨培養(yǎng)與T細胞的混合培養(yǎng)，5 d后通過Amanex-V指標進行細胞凋亡的檢測，具體步驟為：①使用配置好的PBS進行細胞沖洗，采用linger液進行細胞的固定懸浮，進行細胞濃度的調(diào)整，保持在2×106/ml；②選取200 μl細胞懸液進行培養(yǎng)，加入Amanex-V試劑，混勻進行反應(yīng)；③固定1 h后進行細胞計數(shù)，以細胞數(shù)量下降40%為凋亡明顯的標志，統(tǒng)計兩組細胞的凋亡比例〔10〕。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1正常人和CML骨髓來源的MSC形態(tài)及免疫表型對比在光鏡下觀察正常人和CML骨髓來源的MSC形態(tài)無明顯差異，雖然分布略有不同，但均呈成纖維細胞樣附著于管壁生長，細胞間生長排列整齊，不具有特異性差異。檢驗兩種細胞的免疫表型，發(fā)現(xiàn)細胞因子指標中表現(xiàn)為強陽的包括Flk-1及黏附因子CD29、CD44、CD105和CD106，陰性包括CD34、CD45、HLA-DR。故正常人和CML來源的MSC在形態(tài)及免疫表型上的差異無統(tǒng)計學意義。

2.2正常人和CML骨髓來源的MSC對T細胞增殖作用比較正常對照的結(jié)果與既往類似，而患者的增殖抑制作用減弱，且根據(jù)有無刺激和刺激因子分為三組。在正常對照的MSC與PHA 刺激的單核細胞比例為1∶3時，可抑制T細胞增殖5%以下，而當CML骨髓來源的MSC與PHA 刺激的單核細胞培養(yǎng)時，可抑制T細胞增殖的比例為45%；而在比例提升至1∶10及1∶100時此現(xiàn)象更明顯。在混合淋巴細胞反應(yīng)中，結(jié)果與之類似。相對正常人，CML骨髓來源的MSC對T細胞增殖有減輕抑制作用，且MSC比例越大時這種減輕抑制作用越明顯。見圖1。

圖1　正常人和CML骨髓來源的MSC對T細胞增殖作用

2.3正常人和CML骨髓來源的MSC對T細胞周期作用比較選用正常人MSC與T細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可抑制T細胞正常周期，而選用CML骨髓來源MSC發(fā)現(xiàn)這種抑制作用減弱，具體表現(xiàn)為T細胞在增殖周期中大多數(shù)傾向于停留于G0/G1期，而少數(shù)傾向于S期，而分裂間期的縮短即可導致T細胞周期縮短。發(fā)現(xiàn)CML來源患者中此種趨勢不明顯，具有減弱的作用。為保證結(jié)果的準確性選用3T3細胞進行對比研究，發(fā)現(xiàn)3T3細胞改變T細胞增殖周期的作用不明顯。為保證結(jié)果準確性采用T3組、3T3+Ts組作為對照，重點關(guān)注MSC+Ts與CML MSC+Ts的結(jié)果推測T細胞周期改變并根據(jù)對照組排除無關(guān)因素。見圖2。

圖2　正常人和CML骨髓來源的MSC對T細胞周期作用

2.4正常人和CML骨髓來源的MSC對T細胞凋亡作用比較CML骨髓來源的MSC與T細胞培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)凋亡率上升明顯，CD25、CD44、CD29凋亡率各自達到(5.7±2.1)%，(52.3±7.4)%，(28.1±9.2)%，對比正常人來源的MSC與經(jīng)PHA誘發(fā)的T細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)CD25、CD44、CD29綜合凋亡率為(2.4±0.6)%，(19.5±6.5)%，(16.4±0.73)%(t值分別為5.55、8.51、4.66，均P<0.05)。PHA刺激3 d后，T細胞凋亡率為(23.37±2.71)%，和正常的MSC共培養(yǎng)時為(14.1±0.65)%，而和骨髓增生異常綜合征患者來源的MSC共培養(yǎng)時為(8.36±1.31)%。CML來源的MSC可以加強干細胞抑制T細胞凋亡的作用。CML來源的MSC除抑制T細胞增殖和活化的能力減弱外，其抑制T細胞凋亡的能力亦增強。

3討論

白血病是影響當代人群存活率的一種常見惡性病癥，近年來發(fā)病率和死亡率日益增加，而近年來CML研究日益增多〔11〕。而以對抗貧血及誘發(fā)造血為目的的傳統(tǒng)治療效果并不明顯，無法長久維持患者造血功能，且產(chǎn)生一系列免疫系統(tǒng)問題〔12〕。目前探究CML發(fā)病機制可發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)損害及免疫功能異常為影響發(fā)病的主要因素，CML往往合并免疫系統(tǒng)疾病，因此近年來考慮從MSC入手進行治療，維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性〔13〕。體內(nèi)正常存在的MSC比例較小，其免疫調(diào)節(jié)功能易被忽略，但在免疫療法中，可以通過外界輸入等方法增加體內(nèi)免疫細胞中MSC的比例，進而發(fā)揮對體內(nèi)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，此方法適應(yīng)證廣泛，既往已在器官移植等免疫反應(yīng)中進行應(yīng)用〔14〕。當MSC與T細胞比例在1∶100以上時，可忽略此種免疫效應(yīng)而加大MSC比例時，在激活造血系統(tǒng)進行血液成分的再生之外還可非特異性修復(fù)免疫系統(tǒng)，減少因突變、腫瘤等因素對于免疫功能的破壞。MSC這種免疫功能可在體內(nèi)或體外進行，其分布部位反映微環(huán)境位點。而目前考慮可用MSC抑制T細胞增殖、周期，而增強T細胞凋亡的作用進行CML治療〔15〕。尤其對于免疫系統(tǒng)功能低下、造血功能喪失的血液系統(tǒng)疾病具有更大優(yōu)勢。

正常人MSC對T細胞的增殖、細胞周期及凋亡有抑制作用，而CML、MSC對T細胞的影響發(fā)生了一定改變。雖然在形態(tài)和免疫表型上兩種MSC差異不明顯，但CML患者MSC對T細胞的增殖、細胞周期的抑制下降而對T細胞凋亡的抑制作用增強，故難以維持體內(nèi)免疫環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，容易產(chǎn)生自身免疫病等不良后果，故不建議進行自體移植。研究結(jié)束后可進行安全性分析，發(fā)現(xiàn)兩種細胞研究中均出現(xiàn)了一定的誤差性研究結(jié)果。主要包括細胞形態(tài)不清、增殖異常、凋亡明顯等。誤差性結(jié)果相對輕微，且在兩組細胞的研究中差異無統(tǒng)計學意義，對后續(xù)研究干擾較小。

綜上，CML發(fā)病時免疫調(diào)節(jié)功能缺失，骨髓MSC移植可以改善骨髓微環(huán)境和調(diào)節(jié)體內(nèi)異常的免疫狀態(tài)，有利于維持血液系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能，減少合并不良反應(yīng)的發(fā)生〔16〕。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯苑云杰)

〔中圖分類號〕R394.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1063-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.018

第一作者：劉珂(1976-)，女，主治醫(yī)師，主要從事血液學研究。