鄭　健　王　琨

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010050)

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CyclinB1、HPV16蛋白在宮頸組織芯片中的表達(dá)及臨床意義

鄭健王琨

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050)

〔摘要〕目的探討細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和人乳頭瘤病毒16(HPV16)型蛋白在宮頸癌變過程中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化卵白素-生物素-過氧化物酶連接(ABC)法檢測(cè)二者在不同病變宮頸組織芯片(TMA)中的表達(dá)。結(jié)果Cyclin B1、HPV16在宮頸癌中表達(dá)高于正常宮頸(P<0.05)。Cyclin B1表達(dá)在中分化癌組高于高分化癌組及HPV16表達(dá)在鱗癌組高于腺癌組(P<0.05)。Cyclin B1與HPV16表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.46，P<0.01)。結(jié)論HPV16感染可能是導(dǎo)致宮頸癌中Cyclin B1表達(dá)上調(diào)的原因之一。二者協(xié)同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕細(xì)胞周期蛋白B1；人乳頭瘤病毒16型蛋白；宮頸癌；組織芯片；免疫組織化學(xué)

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的必要因素〔1〕，尤以HPV 16型最常見。盡管通過宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和HPV相關(guān)檢測(cè)使宮頸癌及早發(fā)現(xiàn)而死亡率明顯下降，但仍有必要進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制和演變過程以指導(dǎo)臨床治療。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)是細(xì)胞周期 G2/M檢測(cè)點(diǎn)的正性調(diào)控因子，其異常表達(dá)與細(xì)胞異常增生和一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)〔2〕，其是否與宮頸癌發(fā)生有關(guān)及其與HPV16的關(guān)系如何國內(nèi)外少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片(TMA)結(jié)合免疫組化卵白素-生物素-過氧化物酶連接(ABC)法檢測(cè)Cyclin B1和HPV16在正常宮頸上皮、慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)和浸潤癌中的表達(dá)及相關(guān)性。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象收集2007年1月至2012年1月我院手術(shù)切除和活檢的宮頸組織標(biāo)本172例,其中經(jīng)病理確診的正常宮頸上皮27例，慢性宮頸炎42例，CIN 13例，浸潤癌90例。術(shù)前均未接受任何輔助治療。其中宮頸癌患者的年齡30~80(平均52)歲。按照1995年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟頒布的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期21例(均為Ⅱa期)，Ⅰ期、Ⅱ期中盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例，Ⅲ期7例。其中80例鱗癌中高分化24例，中分化47例，低分化9例；10例腺癌中高分化1例，中分化9例。13例CIN中CINⅠ5例、CINⅡ3例、CINⅢ5例。

1.2研究方法所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色，然后對(duì)照HE切片在蠟塊上選定所需的位置，用組織陣列儀抽取組織條作成厚4 μm的連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化ABC法染色。鼠抗人Cyclin B1及鼠抗病毒HPV16單克隆抗體和ABC法試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。染色步驟按試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性片作陽性對(duì)照。由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行觀察。

1.3結(jié)果判定Cyclin B1和HPV16的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒物。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，同樣物鏡下陽性細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，兩類分?jǐn)?shù)乘積小于3分為-，滿3分為+，4分為，5分以上為。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SAS9.0軟件行χ2檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1組織芯片結(jié)果排除制備組織芯片時(shí)有1例未取到宮頸鱗癌組織和染色脫片因素，最終兩張芯片可供分析的例數(shù)：Cyclin B1為112例，其中正常宮頸上皮6例，慢性宮頸炎30例，CIN 7例，浸潤癌69例(Ⅰ期48例，Ⅱ期17例，均為Ⅱa期，Ⅲ期4例，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例。64例鱗癌和5例腺癌，其中高分化19例，中分化44例，低分化6例，年齡>50歲34例，≤50歲35例)。HPV16為119例，其中正常宮頸上皮24例，慢性宮頸炎22例，CIN 4例，浸潤癌69例(Ⅰ期46例，Ⅱ期17例，均為Ⅱa期，Ⅲ期6例，盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例。63例鱗癌和6例腺癌，其中高分化20例，中分化43例，低分化6例，年齡>50歲32例，≤50歲37例)。

2.2Cyclin B1和HPV16在宮頸組織中的表達(dá)Cyclin B1的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。在正常宮頸和宮頸炎中陽性細(xì)胞數(shù)量少，在CIN中陽性細(xì)胞數(shù)增多，著色加深，宮頸癌中陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，著色明顯增強(qiáng)。在宮頸癌中的陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸和宮頸炎(P<0.05)。在CIN中的陽性表達(dá)率較宮頸炎中也顯著增高(P<0.05)。而在其余各組間陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HPV16的陽性表達(dá)呈棕黃色，位于細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫分布。在宮頸炎、CIN和宮頸癌中的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸(P<0.05)，而在其余各組間陽性表達(dá)率比較(P>0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.3Cyclin B1和HPV16的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素的關(guān)系宮頸癌組織中Cyclin B1陽性表達(dá)與組織分化程度有關(guān)。在中、低分化癌中表達(dá)陽性率明顯高于高分化癌，其中高分化癌與中分化癌組之間陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而其陽性表達(dá)與年齡、臨床分期、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)(P>0.05)。HPV16表達(dá)與病理類型有關(guān)，鱗癌中陽性表達(dá)率顯著高于腺癌(P<0.05)。而與年齡、臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1　不同病變宮頸組織中Cyclin B1、

與宮頸炎比較：1)P<0.05；與正常宮頸比較：2)P<0.05

2.4Cyclin B1和HPV16在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性對(duì)兩張芯片共有的58例宮頸癌組織中兩種蛋白表達(dá)行Pearson相關(guān)分析：Cyclin B1與HPV16呈明顯正相關(guān)(r=0.46,P<0.01)。

表2　Cyclin B1、HPV16蛋白表達(dá)與宮頸癌

與高分化比較：1)P<0.05

圖1　Cyclin B1在宮頸癌中表達(dá)(ABC,×200)

圖2　HPV16在宮頸癌中表達(dá)(ABC,×200)

3討論

細(xì)胞周期是通過G1/S,G2/M兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控的。兩檢測(cè)點(diǎn)失控使本來應(yīng)停止增殖或生理性凋亡的 DNA受到損傷或 DNA復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期,因而造成惡性增生〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)Cyclin B1是細(xì)胞周期G2/M檢測(cè)點(diǎn)的正性調(diào)節(jié)因子，也是宮頸癌中的重要調(diào)控分子〔4〕，由于其主要合成于S期和G2期，因而其增多可促使細(xì)胞不斷地進(jìn)入S期和G2期進(jìn)行DNA復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖而癌變。另一方面，由于Cyclin B1在G2/M期表達(dá)最高,其過度表達(dá)使細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促發(fā)癌細(xì)胞克服細(xì)胞周期G2/M期控節(jié)制點(diǎn)進(jìn)入M期,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。本研究發(fā)現(xiàn),隨宮頸病變程度加重,Cyclin B1蛋白陽性表達(dá)率呈升高的趨勢(shì)。與徐詠蓮等〔5〕的研究結(jié)論一致，提示Cyclin B1表達(dá)上調(diào)在宮頸癌變過程中發(fā)揮重要作用，可能是評(píng)價(jià)宮頸癌變的參考指標(biāo)。本研究中其在宮頸癌的陽性表達(dá)率為71.0%,低于陳麗珍等〔6〕報(bào)道的88%，而高于宋敬等〔7〕報(bào)道的52.63%。本文提示Cyclin B1異常表達(dá)可能宮頸癌發(fā)生中的早期事件，這是有助于宮頸癌的早期診斷。這與樊素珍等〔8〕在卵巢癌中得出的結(jié)論相似。本研究說明Cyclin B1表達(dá)與分化程度有關(guān),分化越低,表達(dá)越強(qiáng)，這也與陳麗珍等〔6〕的研究結(jié)論一致。

HPV是小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒,目前已發(fā)現(xiàn)100多型。其中高危型HPV16/18是宮頸癌的重要致病因素。HPV高危型病毒能使宮頸細(xì)胞產(chǎn)生變異，其E6和E7蛋白通過與Rb蛋白作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而E6蛋白能對(duì)抗p53的基因修復(fù)功能，使宮頸細(xì)胞發(fā)展為癌前病變〔9〕。本研究中HPV16蛋白在宮頸癌的陽性表達(dá)率為85.5%,高于邢軍等〔10〕報(bào)道的 75%。這可能與檢測(cè)標(biāo)本均為已標(biāo)記的典型病變區(qū)域有關(guān)。本文結(jié)果表明HPV16感染的累積是引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的一個(gè)重要因素，提示HPV16參與宮頸癌的發(fā)生并起重要作用。對(duì)HPV16的檢測(cè)有助于宮頸癌篩查診斷。本研究還發(fā)現(xiàn)HPV16蛋白在宮頸鱗癌中較腺癌中陽性表達(dá)率高。與李惠新等〔11〕研究認(rèn)為的HPV16主要導(dǎo)致宮頸鱗癌發(fā)生結(jié)論一致。也與李宏等〔12〕研究認(rèn)為的HPV16為宮頸鱗癌主導(dǎo)感染亞型,HPV18為宮頸腺癌主要感染亞型的結(jié)論一致。此外,本研究HPV16感染與宮頸癌的年齡、臨床分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示HPV16持續(xù)感染只是導(dǎo)致宮頸癌變的一個(gè)主要因素,感染后可引起一系列其他基因的改變而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程。

HPV是宮頸癌的主要致病因素,但不是唯一致病因素。HPV對(duì)細(xì)胞的致癌作用需要一個(gè)漫長的積累過程,這種積累可能是細(xì)胞同時(shí)受其他因子損傷的積累過程,也可能是細(xì)胞分裂過程中錯(cuò)誤事件的積累。HPV感染的細(xì)胞發(fā)生惡變需要其他因子的協(xié)同作用。本研究顯示HPV16與Cyclin B1表達(dá)存在正相關(guān)，HPV16感染可能是導(dǎo)致Cyclin B1表達(dá)上調(diào)的原因之一。由于Cyclin B1是細(xì)胞周期G2/M檢測(cè)點(diǎn)的正性調(diào)節(jié)因子，HPV16感染后,其E1、E4蛋白可能通過上調(diào)Cyclin B1表達(dá)，促使細(xì)胞不斷地進(jìn)入G2期進(jìn)行DNA復(fù)制，導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞異常復(fù)制、過度增殖而癌變。這已在Davy等〔13〕的研究中得到證實(shí)。因此認(rèn)為，本研究認(rèn)為，HPV16與Cyclin B1在宮頸癌變中起協(xié)同作用。這與Cho等〔14〕用免疫組化和PCR方法研究認(rèn)為的Cyclin B1表達(dá)與HPV16感染相關(guān)的結(jié)論一致。

綜上，Cyclin B1和HPV16在宮頸癌中的異常表達(dá)說明二者均參與了宮頸上皮細(xì)胞的癌變。HPV16的持續(xù)感染可能是宮頸癌變的起因，而Cyclin B1高表達(dá)則通過加快細(xì)胞周期的進(jìn)程而促進(jìn)具有癌變潛能的細(xì)胞被鎖定在細(xì)胞周期中不斷地進(jìn)行DNA的異常復(fù)制、增殖。二者在宮頸癌變的不同階段扮演者不同的角色，協(xié)同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

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〔2014-07-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類號(hào)〕R737.33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1050-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.012

第一作者：鄭健(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事婦科腫瘤研究。