安　君　李永財(cái)　劉旭光　安　康　高　健　呂君其　李　雄　楊海波

(寧夏人民醫(yī)院　西北民族大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院心胸外科，寧夏　銀川　750021)

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白介素-17A對(duì)壓力過負(fù)荷心衰小鼠的影響

安君李永財(cái)劉旭光1安康2高健呂君其李雄楊海波

(寧夏人民醫(yī)院西北民族大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院心胸外科，寧夏銀川750021)

〔摘要〕目的觀察白介素(IL)-17A、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2以及MMP-9在小鼠過負(fù)荷心衰形成中的影響。 方法選用C57BL/6 野生型小鼠為對(duì)照組，以IL-17A基因敲除小鼠(IL17A-/-)為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)胸骨上窩利用部分夾閉主動(dòng)脈弓心衰模型，測(cè)量心臟體重比(HW/BW)、心臟超聲指標(biāo)、MMP-2以及MMP-9 mRNA表達(dá)。結(jié)果C57BL/6野生型小鼠主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)組(WT-AC組)10 w發(fā)生心衰，與C57BL/6野生型小鼠假手術(shù)組(WT-Sham組)比較，左室舒張末期直徑(LVEDD)和左室收縮末期直徑(LVESD)明顯增大(P<0.01)、 左室后壁舒張末期厚度(LVPWD)和射血分?jǐn)?shù)(EF)明顯變小(P< 0.01)；rIL-17A無變化(P>0.05)，僅LVPWD變小(P< 0.01)；LVPWD和EF變小(P< 0.01)；WT-AC組HW/BW較WT-Sham組增大(P< 0.01)；IL-17A-/-主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)組(IL-17A-/-AC組)與WT-Sham組比較增加(P< 0.01)；和IL-17A-/-假手術(shù)組(IL-17A-/-Sham組)比較亦增加(P< 0.05)；WT-AC組的MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)較WT-Sham組增強(qiáng)(P< 0.01)；rIL-17A腹腔給予WT-Sham組比較其表達(dá)也增強(qiáng)(P< 0.01)；IL-17A-/-AC組與WT-Sham組比較，其mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P< 0.01)；與WT-AC組比較，其表達(dá)明顯下降(P< 0.01)。結(jié)論本研究提示IL-17A基因敲除后心衰過程減緩，MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)增強(qiáng)提示IL-17A直接以及通過MMP-2和MMP-9表達(dá)參與過負(fù)荷心衰過程，IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是減輕、減緩心衰形成、發(fā)展的干預(yù)靶點(diǎn)之一。

〔關(guān)鍵詞〕小鼠；心衰；模型；白介素17A； 基因敲除

心衰是高血壓等多種心血管疾病所共有的終末期病理改變〔1〕。 至今壓力過負(fù)荷所致心衰機(jī)制仍不清楚，是心血管領(lǐng)域亟待解決的熱點(diǎn)。研究心衰的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的基礎(chǔ)是建立穩(wěn)定、可靠心衰模型并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行各種研究。本研究利用穩(wěn)定、可靠的小鼠心衰模型，觀察白介素(IL)-17A〔2〕對(duì)心衰形態(tài)功能以及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 選用8~10周齡、體重20~25 g的成年雄性小鼠。其中 IL-17A基因敲除雄性小鼠(IL-17a-/-)，由日本JUMRO公司石井鐵男惠贈(zèng)。C57BL/6野生型小鼠購(gòu)自吉林白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物的日常管理及實(shí)驗(yàn)研究依照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》和《吉林白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》進(jìn)行。鼠重組IL-17A(rIL-17A)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40 只，隨機(jī)分為5組：C57BL/6 野生型小鼠假手術(shù)組(WT-Sham 組,n=8)；C57BL/6 野生型小鼠主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)組(WT-AC組,n=8)；C57/BL6 假手術(shù)+重組IL-17A腹腔注射組(WT + rIL-17A組,n=8)，該組動(dòng)物于手術(shù)前 10 min注射 2.0 μg rIL-17，術(shù)后每周注射兩次，每次2.0 μg rIL-17A〔3〕，直至5 w；IL-17A基因敲除小鼠假手術(shù)組(IL-17A-/-Sham 組，n=8)；IL-17A基因敲除小鼠主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)組(IL-17A-/-AC組，n=8)。

1.2過負(fù)荷小鼠心衰模型制備戊巴比妥鈉(30 mg/kg體重)腹腔內(nèi)麻醉，在小鼠胸骨上窩縱行切開約1~2 cm皮膚，顯露右無名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈間隙，用鉭夾部分夾閉右無名動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈間的主動(dòng)脈弓(縮窄后主動(dòng)脈直徑為0.35 mm)。假手術(shù)組，手術(shù)操作與模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉。

1.3心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察部分夾閉主動(dòng)脈弓10 w后在相同麻醉下首先進(jìn)行心臟超聲觀察，通過17 MHz探頭(General Electric,Vivid V echocardiograph)觀察左室舒張末期直徑(LVEDD)、左室收縮末期直徑(LVESD)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWD)以及射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.4心/體重比(HW/BW)計(jì)算心臟超聲觀察完畢后將小鼠處死，分別稱體重和心臟重量，獲得心臟HW/BW之比(mg/g)

1.5RT-PCR MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)小鼠心肌組織總RNA 提?。喊碩rizol 法提取說明書提取〔4〕。RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：按RNase H-reverse transcriptase 試劑盒(Invitrogen,USA)說明書步驟進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)：按 SYBR Green Master Mix(Takara,Japan)說明書試劑盒步驟進(jìn)行。應(yīng)用 ABI Prism 7900 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Applied Biosystems，USA)分析，用β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化。

小鼠MMP-2、MMP-9以及β-actin引物序列：基因名稱MMP-2上游引物(5′-3′) ：CACACCAGGTGAAGGATGTG，下游引物(5′-3′)：GCCCTCCTAAGCCAGTCTCT；MMP-9上游引物(5′-3′)：CGTGTCTGGAGATTCGACTTGA，下游引物(5′-3′)；TGGAAGATGTCGTGTGAGTTCC；β-actin上游引物(5′-3′)：CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物(5′-3′)：TTTAATGTCACGCACGATTTC。β-actin(GenBank accession No EF095208)，330 bp，退火溫度58.0℃，MMP-2(GenBank No.NM 004530)，162 bp，退火溫度59.1℃；MMP-9(GenBank No.NM 004994)682 bp，退火溫度62.7℃。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1心臟超聲動(dòng)態(tài)觀察WT-AC組10 w發(fā)生心衰，與WT-Sham組比較，LVEDD和LVESD明顯增大，而LVPWD和EF明顯變小(P<0.01)；WT+rIL-17A組與WT-Sham組比較，LVEDD、LVESD無變化，僅LVPWD和EF變小(P< 0.01)；與WT-AC組比較，IL-17A-/-AC組的LVEDD、LVESD明顯變小，而LVPWD和EF明顯增大(P<0.05)。見表1。

2.2各組HW/BW之比測(cè)定WT-AC組HW/BW〔(7.51 ± 0.48)mg/g〕較WT-Sham組〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕增大(P< 0.05)；WT+rIL-17A組〔(4.30 ± 0.32)mg/g〕與WT-Sham組〔(3.93 ± 0.46)mg/g〕比較無變化(P>0.05)；IL-17A-/-Sham組與WT-Sham組比較無變化(P>0.05)；IL-17A-/-AC組(4.54 ± 0.35)與WT-Sham組(3.93 ± 0.46)和IL-17A-/-Sham組(3.73 ± 0.18)比較明顯增加(P<0.01)。

表1　各組心臟超聲指標(biāo)測(cè)定

與WT-Sham組比較：1)P<0.01; 與WT-AC組比較：2)P<0.05; 與IL-17A-/-Sham組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

2.3各組MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)改變WT-AC組的MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)較WT-Sham組明顯增強(qiáng)(P<0.01)；WT+rIL-17A組與WT-Sham組比較其表達(dá)也明顯增強(qiáng)(P<0.01)；IL-17A-/-AC組與WT-Sham比較，其mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，見表2。

表2　各組MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)改變

與WT-Sham組比較：1)P<0.01;與WT-AC組比較：2)P<0.01；與IL-17A-/-Sham組比較：3)P<0.01

3討論

高血壓等引起心臟后負(fù)荷增加最后導(dǎo)致心衰〔1〕,過負(fù)荷心衰以往大都用結(jié)扎部分主動(dòng)脈方法，這種方法因結(jié)扎材料、打結(jié)方法等原因使其心衰模型形成時(shí)間和心衰程度不一而影響氣候的研究結(jié)果。我們通過固定的鉭夾直徑控制夾閉程度建立心臟過負(fù)荷心衰模型，使其心衰模型形成時(shí)間、程度基本一致，從心衰模型制備上降低了實(shí)驗(yàn)誤差。心衰主要的形態(tài)學(xué)改變是左室擴(kuò)大、舒張功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致全心衰竭〔1,5〕。Il-17A是由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子〔2〕，通過自分泌/旁分泌誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)MMP-2,MMP-9等因子參與心肌損傷、炎癥、心肌纖維化和心臟重塑〔2,6〕。本研究結(jié)果說明過負(fù)荷是引起心衰的主因，IL-17A參與心衰過程，MMP-2和MMP-9也參與心衰過程。另外IL-17A直接參與過負(fù)荷引起的心衰過程，亦通過調(diào)控MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)參與心衰。MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)除了IL-17A外，受其他因子的調(diào)控，提示在過負(fù)荷心衰過程中除IL-17A外，其他因子通過調(diào)控MMP-2和MMP-9表達(dá)機(jī)制參與心衰。本研究提示在過負(fù)荷心衰中心臟超聲中以LVPWD為最早變化(變薄)的指標(biāo)，在心衰早期診斷上具有意義，而IL-17A基因敲除后心衰過程減緩、MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)減弱，提示IL-17A直接以及通過MMP-2和MMP-9表達(dá)機(jī)制參與過負(fù)荷心衰過程，可能成為診斷早期心衰的指標(biāo)，通過干預(yù)IL-17A以及MMP-2和MMP-9通路是減輕、減緩心衰形成發(fā)展的靶點(diǎn)之一。

4參考文獻(xiàn)

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4劉旭光,安君,所劍,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)巨噬細(xì)胞清道夫受體A和B(CD36)功能的影響〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009;35(2): 284-7.

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〔2015-10-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R541.6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1046-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.010

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(200705151, 20080730)

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院心臟外科

2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科

第一作者：安君(1963-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事心衰的機(jī)制研究。