章海風(fēng)　姜明霞　程　音　葉變良　翟成凱

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇　南京　210096)

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三種膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

章海風(fēng)1姜明霞程音1葉變良1翟成凱

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京210096)

〔摘要〕目的探討分別來(lái)源于單一小麥、玉米和多種谷物與豆組合的膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。方法對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，形成單層模型后，培養(yǎng)液中加入膽固醇膠囊和不同濃度的膳食纖維；MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞液中的膽固醇含量。結(jié)果在100 μg/ml的膳食纖維干預(yù)濃度下，3種膳食纖維均顯著減少了高膽固醇狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞單層模型的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(P<0.05)；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，多種谷物與豆組合膳食纖維對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用要好于單一小麥膳食纖維和玉米膳食纖維(P<0.05)。結(jié)論三種膳食纖維，尤其是多種谷物與豆組合膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕膳食纖維；Caco-2細(xì)胞；膽固醇

Caco-2細(xì)胞是來(lái)源于人類結(jié)腸和直腸的癌細(xì)胞〔1〕,是觀察腸道對(duì)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能的經(jīng)典體外模型之一〔2~5〕。作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的良好替代方法〔6〕,可用于檢測(cè)受試物對(duì)腸道膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)影響的研究〔7~9〕。已有的文獻(xiàn)也表明〔10,11〕，膳食纖維(DF)可影響人體小腸對(duì)膽固醇的吸收，調(diào)節(jié)人體的脂代謝,但不同食物來(lái)源的膳食纖維具有不同的功能作用。本文旨在探討來(lái)自小麥、玉米和多種谷物與豆組合的不同來(lái)源膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與材料Caco-2細(xì)胞株由江蘇省中醫(yī)藥研究院提供(美國(guó)休斯頓大學(xué)胡明教授饋贈(zèng))；膳食纖維由本實(shí)驗(yàn)室采用酶-化學(xué)法分別提??；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Equitech-Bio公司；膽固醇、大豆卵磷脂、?；悄懰徕c、膽固醇試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；依折麥布片劑(Ezetimibe)是批準(zhǔn)用于臨床的選擇性膽固醇吸收抑制劑，購(gòu)自新加坡Schering-Plough公司。

1.2Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)將復(fù)蘇后的Caco-2細(xì)胞以2×105/ml密度接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 U/L青霉素-鏈霉素雙抗的不完全DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。定時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%時(shí)用胰酶消化、傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3Caco-2細(xì)胞電阻值的測(cè)定先將Millicell-ERS型細(xì)胞電阻儀的電極在70%乙醇中浸泡15 min，空氣中干燥15 min，然后放入與培養(yǎng)液相似的無(wú)菌電解質(zhì)中浸泡15 min。Caco-2單細(xì)胞層用HBSS沖洗細(xì)胞3次，將電極分別放置于TransWellTM培養(yǎng)板中A側(cè)小室與B側(cè)小室測(cè)定電阻值，并計(jì)算跨膜電阻〔12〕。直徑為2.4 cm的6孔板，電阻值的計(jì)算公式為：TEER=1.2×1.2×3.14×(Ω1-Ω2)(Ω1為干預(yù)前測(cè)量電阻，Ω2為空白電阻)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組(CL)：正常培養(yǎng)，不加干預(yù)物；膽固醇模型組(CH)：膽固醇膠囊培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照組(E)：膽固醇膠囊+10 μmol/L依折麥布；小麥DF(W)：膽固醇膠囊+小麥DF；玉米DF(C)：膽固醇膠囊+玉米DF；多種谷物與豆組合DF(CSC)：膽固醇膠囊+多種谷物與豆組合DF。

1.5膽固醇膠囊溶液的配制膽固醇膠囊作為膽固醇培養(yǎng)液中的膽固醇源，采用溶劑誘導(dǎo)法進(jìn)行配制，具體參照文獻(xiàn)〔13〕。實(shí)驗(yàn)前配制，稱取卵磷脂(0.6 mmol/L)溶于甲醇溶液，超聲后N2干燥；再加入?；悄懰徕c(2 mmol/L)和膽固醇(1 mmol/L)，加入乙醇超聲溶解，N2干燥；最后溶解在pH 7.4的HBSS溶液中,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.63種膳食纖維影響Caco-2細(xì)胞存活率的MTT試驗(yàn)分別將膳食纖維按照不同濃度(50、100、200、400 μg/ml)置于pH7.4培養(yǎng)基中，超聲溶解并通過(guò)0.45 μm的濾過(guò)膜，37℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將Caco-2細(xì)胞以每孔2 000個(gè)的濃度接種到96孔板，每孔體積200 μl，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度的膳食纖維培養(yǎng)基孵育24 h。對(duì)照組為Caco-2細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中孵育24 h，用HBSS溶液洗滌3次后，棄去上清液，加入20 μl MTT溶液，無(wú)血清培養(yǎng)基180 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心棄去上清液，然后加入200 μl DMSO，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移200 μl至新的96孔板中，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫熒光儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值，記錄結(jié)果。

取5孔OD值得均數(shù)，按下公式算出細(xì)胞存活率(IC)：細(xì)胞存活率(IC)= 〔實(shí)驗(yàn)孔OD均值/對(duì)照孔OD均值〕×100%。

98%的細(xì)胞存活所對(duì)應(yīng)的膳食纖維濃度(IC98)作為干預(yù)的敏感劑量，轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)選擇應(yīng)低于此劑量。

1.73種膳食纖維抑制Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的試驗(yàn)方法將小麥DF、玉米DF和多種谷物與豆組合DF分別配制成一定的濃度，溶解在HBSS膽固醇膠囊溶液中，其中陽(yáng)性對(duì)照組為10 μmol/L依折麥布溶液，超聲溶解并通過(guò)0.45 μm的濾過(guò)膜，37℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取符合轉(zhuǎn)運(yùn)條件且細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)完好的TransWellTM膜，移至到有1.5 ml HBSS的新的6孔板，往A側(cè)輕柔加入0.5 ml HBSS，于37℃輕柔振動(dòng)15 min后，HBSS清洗3遍，并檢測(cè)每孔細(xì)胞TEER值3次，取平均值。移出上下兩小室的HBSS緩沖液，盡量吸干凈殘余的液體，然后添加0.4 ml含有膳食纖維的供液于A側(cè)支持膜上，添加1.2 ml HBSS溶液于B側(cè)，分別在不同時(shí)間(0 min、30 min、60 min、90 min及120 min)吸取0.4 ml接收液，同時(shí)補(bǔ)加0.4 ml空白接收液。利用高效液相色譜法測(cè)定膽固醇的含量，最后一次取樣后計(jì)算質(zhì)量平衡。

1.8膽固醇含量的檢測(cè)本文采用高效液相色譜(HPLC)法〔14,15〕測(cè)定Caco-2細(xì)胞滲透液中的膽固醇的含量。色譜條件：色譜柱Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm,2.1 mm×50 mm)。流動(dòng)相：甲醇(100%)。流速為0.3 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，柱溫為38℃，進(jìn)樣量為10 μl。

在已選定的高效液相色譜條件下，將配好的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)試，以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別配制不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/ml,通過(guò)HPLC測(cè)定其峰面積，根據(jù)膽固醇濃度與峰面積的關(guān)系，回歸直線方程為Y=128.4+904.4X，相關(guān)系數(shù)r=0.999。

1.9數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS15.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)、SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Caco-2細(xì)胞單層模型的電阻值本次細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)運(yùn)前細(xì)胞TEER值平均保持在482~595 Ω/cm2左右(CL：534.3±27.0，CH：508.7±51.5，E：507.9±30.5，W：571.2±77.7，C：580.3±50.6，CSC：517.7±42.6)，每孔之間也未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明Caco-2細(xì)胞在TransWellTM板中培養(yǎng)21 d后已經(jīng)形成了完整的單層細(xì)胞模型，可以用于物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)〔16〕。

2.23種膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Caco-2細(xì)胞對(duì)3種膳食纖維的敏感劑量各不一樣。由表1可見(jiàn)，小麥DF和多種谷物與豆組合DF，隨著濃度由50 μg/ml增加到400 μg/ml，其細(xì)胞的存活率(IC)均呈增加趨勢(shì)；玉米膳食纖維濃度在100 μg/ml時(shí)，其細(xì)胞的存活率(IC)最高，表明谷物膳食纖維在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞的存活具有一定的促進(jìn)作用。本次試驗(yàn)選擇膳食纖維干預(yù)的轉(zhuǎn)運(yùn)濃度為100 μg/ml。

2.33種膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響從圖1可以看出，在100 μg/ml的DF干預(yù)濃度下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，每種細(xì)胞液中的膽固醇濃度均呈上升趨勢(shì)。膽固醇模型組上升趨勢(shì)最明顯，30~120 min時(shí)，膽固醇模型組細(xì)胞液中的膽固醇濃度顯著高于其余各組(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響最為明顯，在30 min時(shí)，依折麥布完全抑制了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，30 min后才開(kāi)始檢測(cè)出轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，陽(yáng)性對(duì)照組的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)濃度緩慢上升，膽固醇濃度顯著低于膽固醇模型組和膳食纖維干預(yù)組。與膽固醇模型組相比，膳食纖維組膽固醇濃度顯著降低(P<0.05)。比較3種谷物DF，30 min時(shí)多種谷物與豆組合DF組和小麥DF組，抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的作用好于玉米DF組，而多種谷物與豆組合DF和小麥DF對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)具有相似的抑制性。至120 min實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3種膳食纖維之間未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。在試驗(yàn)過(guò)程中，陰性對(duì)照組細(xì)胞液中始終未檢測(cè)出膽固醇，在圖1中不再顯示。

表1　不同濃度膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(%)

圖1　3種膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

3討論

Caco-2細(xì)胞是來(lái)源于人類結(jié)腸和直腸癌的細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，成為一個(gè)比較理想的體外小腸吸收模型，常常被用來(lái)檢測(cè)一些口服藥物和外源性物質(zhì)的吸收效果。經(jīng)過(guò)21 d左右的培養(yǎng)，形成單層模型，在腸腔側(cè)分化出絨毛面AP側(cè)(腸腔側(cè))和基底面BL側(cè)(腸內(nèi)壁側(cè))。AP側(cè)含有典型的小腸微絨毛水解酶和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可發(fā)揮主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的作用，如糖類、氨基酸、膽酸及維生素B內(nèi)源性因子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體在Caco-2細(xì)胞都有表達(dá)；存在于小腸細(xì)胞刷狀緣的酶，如氨肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶等也同樣存在于細(xì)胞中。研究物質(zhì)從小腸的漿膜層到黏膜側(cè)和從黏膜側(cè)到黏膜層吸收特性，可以清晰地表達(dá)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)與排泄方式〔17〕。利用細(xì)胞電阻儀測(cè)定跨上皮細(xì)胞的電阻，是一個(gè)常用的、有效的方法，可反映出經(jīng)過(guò)21 d培養(yǎng)后的Caco-2單層細(xì)胞緊密性和完整性，決定培養(yǎng)后的Caco-2細(xì)胞能否進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)7 d后達(dá)到融合，10 d后細(xì)胞開(kāi)始均勻致密，在光學(xué)顯微鏡下可清晰看見(jiàn)呈多角形扁平狀的單個(gè)細(xì)胞體，多細(xì)胞間緊密連接，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致〔18〕。Caco-2細(xì)胞在TransWellTM板中培養(yǎng)21 d后已經(jīng)形成了完整的單層細(xì)胞模型，可以用于本文膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

目前，已有較多關(guān)于利用Caco-2細(xì)胞單層模型來(lái)觀察藥物或外源性物質(zhì)對(duì)人體小腸膽固醇吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)影響的實(shí)驗(yàn)研究。馮丹等〔19〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，25～100 μmol/L姜黃素可有效降低Caco-2細(xì)胞NPC1L1的基因和蛋白表達(dá)，顯著抑制細(xì)胞膽固醇的吸收。趙戰(zhàn)芝等〔20〕利用Caco-2細(xì)胞模型來(lái)研究大蒜素對(duì)腸道膽固醇外排及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)基因ABCG5/ABCG8表達(dá)的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，膽固醇微膠?？稍黾覥aco-2細(xì)胞內(nèi)脂滴和膽固醇含量，而大蒜素可減少膽固醇微膠粒處理后Caco-2細(xì)胞內(nèi)脂滴和膽固醇含量，增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出率，并可顯著上調(diào)Caco-2細(xì)胞ABCG5和ABCG8的蛋白水平。因此，在借鑒文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，筆者通過(guò)建立Caco-2細(xì)胞模型，研究小麥、玉米和多種谷物與豆組合3種膳食纖維對(duì)膽固醇吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。同時(shí)，考慮到膳食纖維是一種難溶性的物質(zhì)，而且理論上也無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究了膳食纖維對(duì)膽固醇從AP側(cè)到BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。本章實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，膽固醇模型組Caco-2細(xì)胞中，膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，而3種膳食纖維和陽(yáng)性對(duì)照物可明顯抑制高膽固醇狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞中膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。依折麥布是一種用于臨床的選擇性膽固醇吸收抑制劑，可作用于小腸細(xì)胞的刷狀緣，以甾醇載體(NPC1L1)為分子靶點(diǎn)〔21〕，選擇性地抑制腸道對(duì)食物中TC以及膽汁中TC的吸收，從而使膽固醇由腸道向肝臟運(yùn)輸相應(yīng)減少〔22〕。膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用，可能是調(diào)節(jié)了Caco-2細(xì)胞單層模型中NPC1L1的表達(dá)，從而抑制了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)；其次，已有的研究表明，膳食纖維具有一定的持水性、膨脹性、黏稠性和吸附性等理化特性，因此，吸水溶脹的膽固醇，增加了細(xì)胞液的黏稠性，阻礙了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。膳食纖維對(duì)膽固醇的物理性吸附，也降低了膽固醇的濃度，從而降低了膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3種膳食纖維對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)出了不同的抑制效果。多種谷物與豆組合膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用好于小麥DF和玉米DF組，但三者之間未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，還需要作進(jìn)一步的深入研究。不同食物來(lái)源的膳食纖維對(duì)人體健康的保健作用有所不同，這與其自身結(jié)構(gòu)、理化特性和來(lái)源具有一定的關(guān)聯(lián)。根據(jù)本課題組之前的研究表明，多種谷物與豆組合DF比單一的小麥DF和玉米DF ,具有更強(qiáng)的持水性、膨脹性和膽固醇吸附能力等，這可能是多種谷物與豆組合DF對(duì)膽固醇的抑制作用好于單一小麥DF和玉米DF的原因之一。

綜上，膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收有一定的抑制作用。其作用機(jī)制可能是物理性地阻礙了膽固醇物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，也可能是通過(guò)抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NPC1L1表達(dá)，降低腸細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。膳食纖維對(duì)Caco-2細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響可能是多渠道的，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-11-20修回〕

(編輯曲莉)

Effects of three kinds of dietary fiber on cholesterol transport in Caco-2 cells

ZHANG Hai-Feng, JIANG Ming-Xia, CHENG Yin,etal.

School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210096,Jiangsu, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the dietary fiber (DF) from wheat (W), corn (C), and cereal-soybean combination(CSC) on cholesterol transport in Caco-2 cells.MethodsThe human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 was cultured in vitro. After the monolayer model was formed, cholesterol micelles and different concentrations of dietary fiber were added into the culture medium. The growth of cells was detected by MTT colorimetry. The cholesterol content in the cell was determined by HPLC.ResultsIn the intervene of 100 mg/ml DF concentration, three kinds of DF were significantly reduced cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model under the high cholesterol concentration(P<0.05). To the end of the experiment, the inhibition effect of the CSC dietary fiber on cholesterol transport was better than that of wheat DF and corn DF(P<0.05).ConclusionsThree kinds of DF, especially DF of cereal-soybean combination, could inhibit cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model.

【Key words】Dietary fiber; Caco-2 cell; Cholesterol

〔中圖分類號(hào)〕R39

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1032-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.004

通訊作者：翟成凱(1947-)，男，教授，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與健康研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81372986；30471451)

1揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院

第一作者：章海風(fēng)(1977-)，男，講師，在讀博士，主要從事膳食營(yíng)養(yǎng)與健康研究。