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        高效液相色譜法同時測定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

        2016-04-13 07:18:35朱燕黃義純嚴曉明
        廣東藥科大學學報 2016年5期
        關鍵詞:毛蕊花柚皮苷淫羊

        朱燕,黃義純,嚴曉明

        (韶關市食品藥品檢驗所,廣東 韶關 512028)

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        藥物分析

        高效液相色譜法同時測定抗骨增生膠囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷

        朱燕,黃義純,嚴曉明

        (韶關市食品藥品檢驗所,廣東 韶關 512028)

        目的 建立同時測定抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分質量分數的高效液相色譜法。方法 采用依利特Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以水(A)、甲醇(B)、乙腈(C)為流動相進行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,檢測波長為270 nm,柱溫為30 ℃。結果 毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷測定的線性范圍分別為5.02~100.4、7.38~147.6 和5.20~104.0 μg/mL,r值均大于0.999,平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%和99.3%,RSD值均小于2.0%(n=6)。結論 本方法簡便、結果準確,可有效地控制抗骨增生膠囊的質量。

        高效液相色譜; 抗骨增生膠囊; 毛蕊花糖苷; 柚皮苷; 淫羊藿苷

        抗骨增生膠囊為國家基本醫(yī)療保險藥品目錄收載品種,是由熟地黃、雞血藤、酒肉蓯蓉、炒萊菔子、狗脊、骨碎補、女貞子(鹽制)、淫羊藿、牛膝9味中藥制成的中藥成方制劑,收載于《中國藥典》2015年版一部[1]950,用于增生性脊椎炎(肥大性胸椎炎,肥大性腰椎炎)、頸椎綜合征和骨刺等疾病[2]。熟地黃、淫羊藿、骨碎補均為該復方制劑的主要藥味,其主要活性成分分別為毛蕊花糖苷(verbascoside)、淫羊藿苷(icariine)等黃酮類和柚皮苷(naringin)等二氫黃酮類化合物[1]256,124,其藥效與該制劑功能主治相一致??构窃錾z囊現行標準[1] 950僅對淫羊藿苷進行質量分數測定,未能全面控制其質量,國內亦未見對抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種有效成分質量分數同時進行測定的報道及文獻。為了較全面控制抗骨增生膠囊質量并簡化其測定方法,筆者參考文獻[1] ,[2-4],以毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷為指標性成分,采用HPLC法同時測定它們在抗骨增生膠囊中的質量分數,以控制方中熟地黃、淫羊藿、骨碎補等主藥的質量。

        1 儀器與試藥

        Agilent1260 高效液相色譜儀(包括VWD 檢測器LC solution 工作站),AG-135 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司),HT-300BQ 超聲儀(山東濟寧恒通超聲電子設備有限公司),Shimadzu UV-2450 紫外分光光度計。

        毛蕊花糖苷對照品(批號111530-201512,質量分數96.7%)、柚皮苷對照品(批號110722-201312,質量分數94.7%)、淫羊藿苷對照品(批號110737-201516,質量分數94.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院,抗骨增生膠囊購自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司(0.35 g/丸,批號:141105、141209、150501)。甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑為分析純。水為超純水。

        2 方法與結果

        2.1 色譜條件

        色譜柱為依利特Hypersil ODS2柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為H2O(A)-甲醇(B)-乙腈(C),按表1程序進行梯度洗脫。檢測波長為270 nm,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃。

        表1 抗骨增生膠囊中3種有效成分測定的梯度洗脫程序

        Table 1 Gradient elution program of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules

        t/minφ(流動相A)/%φ(流動相B)/%φ(流動相C)/%08002013800201470525267052528800203780020

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對照品適量,精密稱定,用50%乙醇(體積分數,下同)溶解并定量稀釋制成質量濃度分別為0.502、0.738、0.520 mg/mL 的溶液,作為對照品儲備溶液。分別精密量取上述3種對照品儲備溶液2 mL,置于同一20 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,作為毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷質量濃度分別為0.050 2、0.073 8、0.052 0 mg/mL的混合對照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液的制備 取抗骨增生膠囊內容物10粒,精密稱定,混勻,研細,取約0.7 g,精密稱定。置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)45 min,放冷,用50%乙醇補足減失的質量,搖勻,濾過,續(xù)濾液作為供試品溶液。

        2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量制備缺熟地黃、淫羊藿和骨碎補的樣品,同“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

        2.3 系統(tǒng)適用性試驗

        分別精密吸取混合對照品、供試品、陰性樣品溶液10 μL,按“2.1”項下色譜條件進樣分析,記錄色譜圖,見圖1。結果理論塔板數按毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷計算均不低于3 500,3種成分色譜峰與相鄰峰之間分離度均大于1.5,對稱因子在0.95~1.05 內;陰性對照無干擾。

        t/min6040200200150100500806040200mAUmAUmAUABC12332110152025303505

        1.毛蕊花糖苷; 2.柚皮苷; 3.淫羊藿苷。

        圖1 混合對照品(A)、供試品(B)和陰性樣品(C)溶液的HPLC色譜圖

        Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative sample(C)

        2.4 線性關系的考察

        分別精密量取毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷對照品儲備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL,置于同一25 mL容量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。以峰面積(A)對質量濃度(ρ)進行線性回歸,得到3種成分的回歸方程、r及線性范圍,結果見表2。

        表2 抗骨增生膠囊中3種成分的回歸方程、r值及線性范圍

        Table 2 Regression equations,rvalues and linear ranges of three constituents in Kanggu Zengsheng capsules

        成分回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)毛蕊花糖苷A=8.422ρ+19.231230.99925.02~100.4柚皮苷A=8.317ρ+20.125380.99967.38~147.6淫羊藿苷A=20.971ρ+25.361840.99965.20~104.0

        2.5 檢測限的測定

        將“2.4”項下質量濃度最低的對照品溶液逐級稀釋,依法進行測定,當各成分峰的信噪比為3∶1時,計算得毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的最低檢測限分別為0.22、0.30、0.13 ng。

        2.6 精密度試驗

        取同一批供試品溶液(批號:150501)10 μL,連續(xù)進樣6次,按“2.1”項下色譜條件測定并記錄色譜圖。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=6)分別為0.72%、0.77%、0.58%,表明本法精密度良好。

        2.7 穩(wěn)定性試驗

        取同一批供試品溶液(批號:150501),分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h進樣,按“2.1”項下色譜條件測定并記錄色譜圖。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積平均值的RSD值(n=7)分別為0.82%、0.68%、0.79%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

        2.8 重復性試驗

        平行取同一批抗骨增生膠囊(批號:150501) 共6 份,每份0.7 g,精密稱定,分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件測定并記錄峰面積。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.2%和1.0%,表明方法重復性良好。

        2.9 加樣回收率試驗

        分別取已知質量分數(毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷分別為0.39、0.56、0.51 mg/丸)的抗骨增生膠囊(批號:150501)約0.7 g,精密稱定,共6份,分別精密加入3種對照品儲備液0.5 mL,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定并計算回收率。結果毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷的平均加樣回收率分別為100.7%、100.4%、99.3%,RSD值(n=6)分別為1.7%、1.6%、1.3%。結果見表3。

        表3 抗骨增生膠囊中3種有效成分的加樣回收率試驗結果Table 3 Recovery results of three active ingredients in Kanggu Zengsheng capsules (n=6)

        2.10 樣品的測定

        分別取3批抗骨增生膠囊(批號:141105、141209、150501),約0.7 g,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,每批平行處理3份,按“2.1”項下色譜條件測定,按峰面積外標法計算其中3種有效成分的質量分數,結果見表4。

        表4 抗骨增生膠囊中3種有效成分的質量分數測定結果

        3 討論

        3.1 流動相的選擇

        由于抗骨增生膠囊中各成分性質差異較大,為使3種有效成分達到良好分離效果,筆者分別以不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%(體積分數)醋酸等為流動相系統(tǒng)[4-7]對色譜條件進行考察,但分離效果均不甚理想。如以乙腈-水(體積比20∶80)為流動相時,毛蕊花糖苷、柚皮苷出峰好,但淫羊藿苷保留時間過長,而且雜質分離效果差,峰形較差;經過進一步對比研究,最終選擇甲醇-乙腈-水三相系統(tǒng)為流動相梯度洗脫,可消除雜質對被測成分的干擾,各成分的色譜峰峰形對稱、理論塔板數高、分離度好,縮短了多成分檢測的分析時間。

        3.2 波長的選擇

        采用紫外可見分光光度法檢測毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷對照品溶液,以初始比例流動相為空白,在200~400 nm范圍內進行掃描,兼顧多種成分的最大吸收,重點考察334、284、270 nm波長處的效果。結果發(fā)現在270 nm波長處,3種有效成分均有較強吸收,因此選擇淫羊藿苷的最大吸收波長270 nm作為檢測波長,可同時得到3種成分較好的色譜峰,并能滿足定量測定的要求。

        3.3 樣品前處理方法的確定

        筆者分別對文獻中較常見的冷浸法、回流提取法、超聲法[4-7]這3種提取方法方法進行了考察,結果顯示:采用冷浸法提取時,為獲得較好的效果,需不定期振搖,且浸泡時間長、提取效率較低;回流提取40 min可基本提取完全,但提取溫度較高,可能對其活性成分產生較大的影響,活性成分質量分數隨著溫度的提高均有不同程度的降低[8];而超聲法可在30 min內基本提取完全,且具有提取時間短、提取溫度低、提取率高等特點,所以選用超聲法提取??疾炝颂崛r間分別為15、30、45、60 min時的超聲提取效果,結果表明,超聲處理30 min 后各成分質量分數不再增加,考慮到樣品間的差異性,選擇超聲處理45 min。在提取溶劑方面,分別采用乙醇、50%乙醇、50%甲醇、甲醇作為溶劑對樣品進行提取。結果表明:50%甲醇和50%乙醇超聲提取完全且雜質干擾峰較少,結果差異不大;但甲醇毒性較乙醇大,結合經濟實用的角度考慮,選擇50%乙醇作為提取溶劑。

        本文所確定方法操作簡便、重復性好、準確穩(wěn)定,能快速、準確地對抗骨增生膠囊中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3種成分同時進行定量測定,為該制劑質量標準的提高提供了重要參考。

        [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015年版一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

        [2] 朱靜,楊青青.抗骨增生膠囊中柚皮苷的HPLC法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2013,44(8):795.

        [3] 韓麗萍,陳行愉,劉志剛.HPLC法同時測定抗骨質疏松中成藥中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中國藥房,2010,21(43):4083-4085.

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        [5] 薛標強,袁潔麗.HPLC法測定抗骨增生片中柚皮苷的含量[J].輕工科技,2014,1(1):105-106.

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        [8] 王亮,張巧艷,年華,等.用HPLC法測定地黃葉中毛蕊花糖苷的含量[J].藥學服務與研究,2015,15(1):26,30,46.

        (責任編輯:劉曉涵)

        Simultaneous determination of verbascoside,naringin and icariin in Kanggu Zengsheng capsules by HPLC

        ZHU Yan,HUANG Yichun,YAN Xiaoming

        (ShaoguanInstituteforFoodandDrugControl,Shaoguan512028,China)

        Objective To establish an HPLC method for determinations of three constituents(verbascoside,naringin and icariin ) in Kanggu Zengsheng capsules. Methods HPLC gradient elution method was applied. The column was Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was water(A),methanol(B)and acetonitrile(C) solution. The detection wavelength was set at 270 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The linear range was 5.02-100.4 μg/mL for verbascoside,7.38-147.6 μg/mL for naringin and 5.20-104.0 μg/mL for icariin,respectively. All the correlation coefficients were above 0.999. The average recovery was 100.7% for verbascoside,100.4% for naringin,and 99.3% for icariin,respectively,and all RSD values were less than 2.0%(n=6). Conclusion The developed HPLC method could be used for the quality control of Kanggu Zengsheng capsules.

        HPLC; Kanggu Zengsheng capsules; verbascoside; naringin;icariin

        2016-06-23

        朱燕(1983—),本科,主管藥師,從事藥品質量檢驗與質量控制研究,Email:29711825@qq.com;通信作者:嚴曉明(1979—),副主任藥師,從事藥品質量檢驗與質量控制研究,Email:99075234@qq.com。

        時間:2016-09-30 15:09

        http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1509.009.html

        R284.1

        A

        1006-8783(2016)05-0589-04

        10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062301

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