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·綜述·

耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)的研究進(jìn)展

肖茜1劉洋1閔美平1榮威林2綜述張志遠(yuǎn)1審校

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-2-116:19

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160201.1619.024.html

哺乳動(dòng)物及人的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion cells，SGCs)位于耳蝸骨螺旋板和蝸軸基部的Rosenthal小管內(nèi)，其外周突通過(guò)骨螺旋板內(nèi)的小管進(jìn)入螺旋器分布于內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞。SGCs的主要功能是將耳蝸毛細(xì)胞機(jī)電轉(zhuǎn)換的信息向聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)各級(jí)中樞傳遞[1]。內(nèi)耳受損后會(huì)以SGCs數(shù)目變化為特征表現(xiàn)，噪聲、年齡老化和耳毒性藥物等損傷因素均會(huì)造成SGCs突觸退化、軸索變性及胞體的損傷，從而影響聽(tīng)力，造成人類不同程度的交流障礙[2]。對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)能更好地研究耳蝸受損后的病理生理機(jī)制和定量反映內(nèi)耳的損傷程度，因此，本文就近年來(lái)關(guān)于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)及計(jì)數(shù)研究進(jìn)展綜述如下。

1耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)的研究

1.1螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常形態(tài)及數(shù)目螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是耳蝸聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的重要組成部分，其將毛細(xì)胞的機(jī)械振動(dòng)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)而傳入聽(tīng)覺(jué)中樞產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的任何部位病變都將影響聽(tīng)功能[3～5]。不同物種，如：人[4]、貓[6]、鼠[7]、猴[8]等的SGCs形態(tài)結(jié)構(gòu)是相似的，但數(shù)目卻不同，不同種屬的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目見(jiàn)表1[9～11]；從表中可見(jiàn)不同物種在不同計(jì)數(shù)方法下的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目不同。根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)及其周?chē)坏牟煌?，可將SGCs分為Ⅰ型和Ⅱ型神經(jīng)元。Ⅰ型神經(jīng)元胞體較大，為雙極神經(jīng)元，占神經(jīng)節(jié)細(xì)胞總數(shù)的90%～95% , 胞體內(nèi)富含核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，胞核大而圓，顏色較暗沉，位于胞體中心，胞體及周?chē)挥兴枨拾@，周?chē)慌c內(nèi)毛細(xì)胞底部共同構(gòu)成匯聚型突觸聯(lián)系；Ⅱ型神經(jīng)元胞體較Ⅰ型細(xì)胞小，形態(tài)多變，為雙極或假單極，占總數(shù)的5%～10%，其胞質(zhì)為高度細(xì)絲狀，細(xì)胞器較少，其細(xì)胞核顏色較深，胞核可呈分葉狀，位置多變，一般無(wú)髓鞘或僅有薄層髓鞘包繞，周?chē)慌c外毛細(xì)胞形成突觸聯(lián)系[4,12,13]。通過(guò)光鏡定位Rosenthal 小管，發(fā)現(xiàn)其中細(xì)胞核大而核仁明顯者即為SGCs[14]；如果想鑒別SGCs的兩種細(xì)胞類型，則需用電鏡觀察其形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分[7]。

表1　不同物種的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目

1.2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷后形態(tài)及聽(tīng)功能變化聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)老化、耳毒性藥物、強(qiáng)噪聲等因素均可導(dǎo)致內(nèi)耳組織，如：毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、支持細(xì)胞等出現(xiàn)凋亡、壞死[15]。在年齡相關(guān)性變化中，劉強(qiáng)和等[16]觀察到小鼠的SGCs胞體變小，周?chē)枨时澜鈹嗔?，部分?xì)胞胞核濃縮，并且計(jì)數(shù)TUNEL染色陽(yáng)性率，即凋亡細(xì)胞的比率約為11.364%±4.96%，其ABR反應(yīng)閾提高了20 dB；獼猴隨年齡增長(zhǎng)SGCs的密度減小，并且高頻聽(tīng)力逐漸下降[8]；聶深等[17]給小鼠注射卡那霉素聯(lián)合呋塞米后，在電鏡下可見(jiàn)典型的SGCs變性，且其ABR反應(yīng)閾較正常鼠提高40 dB左右；在卡那霉素作用下，豚鼠SGCs髓鞘逐漸退化消失，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，尤其是底回[10]；在噪聲暴露后，在電鏡下可見(jiàn)SGCs胞核固縮，胞漿出現(xiàn)空泡化，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被吞噬細(xì)胞吞噬[18]；觀察缺血缺氧性腦病小鼠耳蝸的超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)異常及細(xì)胞膜不規(guī)則，部分區(qū)域的胞質(zhì)變質(zhì)及周邊衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)改變并出現(xiàn)聽(tīng)力下降[19]。由此可見(jiàn)，不同因素導(dǎo)致的SGCs損傷有著相同的病理過(guò)程，即損傷后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)程度的SGCs形態(tài)變異甚至壞死，使SGCs數(shù)目減少；這種變化最早出現(xiàn)在線粒體，隨后出現(xiàn)胞核、胞質(zhì)及其他細(xì)胞器的變性，并可導(dǎo)致不同程度的聽(tīng)力損傷；在光鏡下可見(jiàn)SGCs數(shù)目減少，胞體變小，胞核縮小，髓鞘退化；而特殊TUNEL染色能夠檢測(cè)細(xì)胞DNA的斷裂，PI細(xì)胞核染色能夠敏感的檢測(cè)出細(xì)胞凋亡，在電鏡下典型的變化是細(xì)胞器尤其是線粒體腫脹、消失，胞質(zhì)空泡化，胞核皺縮；而細(xì)胞凋亡是SGCs在損傷狀態(tài)下死亡的主要方式。

2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

2.1標(biāo)本選取觀察計(jì)數(shù)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之前，先要對(duì)耳蝸進(jìn)行取材，不同的取材方式對(duì)SGCs的計(jì)數(shù)影響不同。單純進(jìn)行螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，可以隨機(jī)選取耳蝸，行中軸超薄切片進(jìn)行觀察，而大部分對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)的研究中同時(shí)需要對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，這就涉及到是要在不同個(gè)體上，還是同一個(gè)體不同耳蝸上，或者同一個(gè)體同一耳蝸上進(jìn)行兩者的觀察；有學(xué)者[20]收集4組豚鼠耳蝸，經(jīng)脫鈣后，從各組選取3個(gè)耳蝸進(jìn)行基底膜鋪片，另選5個(gè)耳蝸行耳蝸中軸切片，發(fā)現(xiàn)該方法收集的耳蝸忽略了個(gè)體差異，所以其最終結(jié)果的可靠性會(huì)降低。Keithly[21]選用小鼠的一側(cè)耳蝸取其基底膜用于毛細(xì)胞觀察，另一側(cè)耳蝸行中軸連續(xù)半薄切片觀察計(jì)數(shù)SGCs，該方法可減少抽樣誤差，對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)可靠性及效率，不失為一種有效的變通方法。Spoendlin等[22]將貓及豚鼠的耳蝸整體包埋，在鏡下沿耳蝸中軸將耳蝸一切為二，然后從頂回至底回逐漸切下每回，獲得含完整的螺旋器、前庭膜以及螺旋神經(jīng)節(jié)組織的包埋塊，將包埋塊直接于鏡下觀察螺旋器，或?qū)⑵溥B續(xù)切片用于觀察SGCs；該方法可觀察同一耳蝸上毛細(xì)胞和SGCs的變化，有利于發(fā)現(xiàn)病變的起始部位及其發(fā)展規(guī)律，但是在切分耳蝸的同時(shí)會(huì)有SGCs的缺失，影響SGCs計(jì)數(shù)。Bohne等[23]將栗鼠耳蝸包埋之后沿平行基底膜盤(pán)旋方向從蝸?lái)斚蛭伒讓⒒啄で衅?，取下的基底膜切片鋪片行毛?xì)胞觀察計(jì)數(shù)，保留的蝸軸制備成連續(xù)切片用于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，該方法避免了大量SGCs的物理?yè)p傷，但是制備過(guò)程比較繁雜，容易損傷神經(jīng)纖維孔，且需要很精準(zhǔn)的技術(shù)。Johnsone等[24]選取小鼠的整個(gè)耳蝸?zhàn)鳛闃?biāo)本，不進(jìn)行切片處理，在三維結(jié)構(gòu)下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及計(jì)數(shù)，該方法保留了耳蝸立體結(jié)構(gòu)且可將耳蝸組織細(xì)胞損傷的幾率降到最小。可見(jiàn)，對(duì)標(biāo)本的選取應(yīng)依照目的要求來(lái)進(jìn)行，但是在允許的條件范圍內(nèi)應(yīng)盡可能將各種影響因素降到最低，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。

2.2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

2.2.1直接鏡下人工計(jì)數(shù)法早在二十世紀(jì)三十年代Howe[25]用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞輪廓直接計(jì)數(shù)SGCs，到二十世紀(jì)六七十年代后該方法應(yīng)用開(kāi)始增多，并且沿用至今。直接鏡下人工計(jì)數(shù)法是對(duì)耳蝸中軸進(jìn)行連續(xù)切片，計(jì)數(shù)每個(gè)樣本中的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目；由于相鄰切片的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量變化不大，故改為間隔數(shù)張切片進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)[26,27]；還有學(xué)者采用分別計(jì)數(shù)各回的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)以避免因細(xì)胞分布不均造成的誤差。另外，有國(guó)內(nèi)學(xué)者采用目鏡加網(wǎng)格片的方法，在40×10倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)10 μm×10 μm小格內(nèi)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出8個(gè)網(wǎng)格面積范圍內(nèi)的有核神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)，然后取連續(xù)4張中軸切片的均數(shù)[28]。Schettino等[29]利用小格面積為2 500 μm2的網(wǎng)格片覆蓋在切片上，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)9到15個(gè)小格有核細(xì)胞數(shù)然后取其均數(shù)，算出螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的密度。網(wǎng)格法能夠節(jié)約大量的時(shí)間，但因同一個(gè)中軸切面上，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分布是不均勻的，存在有效面積和無(wú)效面積(SGCs在耳蝸內(nèi)的分布并不完全均一，尤其是在細(xì)胞受到損傷的情況下，有些局部區(qū)域會(huì)出現(xiàn)只有少量或是沒(méi)有細(xì)胞的情況，和網(wǎng)格計(jì)算出來(lái)的細(xì)胞密度相差很大，在這種情況下該部位為一個(gè)無(wú)效面積)，其結(jié)果可能存在計(jì)量誤差。可見(jiàn)直接鏡下人工計(jì)數(shù)法既有其優(yōu)點(diǎn)，但也存在不可忽視的缺點(diǎn)。

2.2.2計(jì)算機(jī)圖像輔助計(jì)數(shù)法在二十世紀(jì)八九十年代，國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛應(yīng)用電腦截取圖像的計(jì)數(shù)方法來(lái)輔助計(jì)數(shù)。方耀云等[30]在光學(xué)顯微鏡下掃描切片，將圖像傳輸至圖像監(jiān)視器上，將原始圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理軟件進(jìn)行增強(qiáng)處理后，使細(xì)胞輪廓更清晰，便于觀察計(jì)數(shù)，將細(xì)胞核輪廓清晰者計(jì)數(shù)，在圖像監(jiān)視器上將SGCs逐個(gè)標(biāo)記。該法聯(lián)合計(jì)算機(jī)，將已經(jīng)計(jì)數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，能夠避免重復(fù)計(jì)數(shù)或遺漏，并且可以多人同時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)，但與直接鏡下計(jì)數(shù)法一樣需要耗費(fèi)較多的精力和時(shí)間。

2.2.3計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)分析計(jì)數(shù)法從二十世紀(jì)九十年代開(kāi)始出現(xiàn)應(yīng)用軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)的方法，該方法首先對(duì)耳蝸行間隔取片處理，染色，鏡下觀察，用連接顯微鏡上的攝像機(jī)攝取圖像，先用選定的細(xì)胞作為模型，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，然后直接應(yīng)用圖像處理軟件對(duì)視野范圍內(nèi)符合條件的細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)[31,32]；Nie等[33]對(duì)耳蝸中軸連續(xù)切片，每5張切片中挑出一張進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)算耳蝸各回的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)目，測(cè)量Rosenthal小管的面積，測(cè)量該小管內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，求其密度，取均值。該方法與之前測(cè)量整個(gè)中軸的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)目相比，能夠更準(zhǔn)確的反映SGCs數(shù)目的變化，消除了耳蝸不同部位SGCs數(shù)量不同的影響，能夠精準(zhǔn)的反映有效面積下SGCs的分布。然而，圖像處理軟件往往很難區(qū)分染色效果欠佳的細(xì)胞或因病變而形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小及著色異常的受損細(xì)胞，尤其是在混有不同的組織細(xì)胞部位，所以在軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)的時(shí)候往往需要人工隨時(shí)糾正其識(shí)別誤差以增加結(jié)果的準(zhǔn)確率及可信度。目前該法是研究SGCs應(yīng)用最廣的計(jì)數(shù)方法。

2.2.4連續(xù)切片三維結(jié)構(gòu)重建法二十一世紀(jì)初期以來(lái)，有部分學(xué)者利用三維重建法對(duì)SGCs進(jìn)行計(jì)數(shù)。該法對(duì)所獲得的耳蝸組織連續(xù)圖像通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行提取輪廓及分割處理，構(gòu)建其三維立體圖形并進(jìn)行細(xì)胞定量。Schettino等[29]應(yīng)用數(shù)學(xué)關(guān)系的體視學(xué)法(design-based stereology)將耳蝸立體結(jié)構(gòu)重建并觀察和計(jì)量螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和密度，其方法是取下耳蝸，經(jīng)固定、脫鈣、梯度脫水及包埋后，以40 μm的厚度沿平行中軸方向切片，逐一拍攝，重建時(shí)通過(guò)SI軟件的輔助下對(duì)中軸連續(xù)切片進(jìn)行重建，得到重建的三維模型，計(jì)數(shù)出小鼠的SGN細(xì)胞數(shù)和密度，并與以往的其他計(jì)數(shù)方式結(jié)果進(jìn)行對(duì)比研究，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Richter等[9]將耳蝸沿蝸軸水平切片，將切片染色后按順序拍照，將一系列切片進(jìn)行重建，應(yīng)用數(shù)字化成像聯(lián)合Adobe Photoshop處理軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，首先標(biāo)示出第一張切片上所有SGCs及該切面標(biāo)示性的輪廓，計(jì)數(shù)SGCs數(shù)目，然后將標(biāo)示出的簡(jiǎn)易圖與第二張切片圖進(jìn)行整合，再對(duì)該圖中沒(méi)有標(biāo)示的所有SGCs進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)示簡(jiǎn)易圖整合至下一張切片，以此類推，將得到的所有SGCs數(shù)目累積相加。利用數(shù)字化成像及軟件輔助三維成像的方法能夠比較精確的計(jì)量細(xì)胞數(shù)，減少計(jì)量誤差，不僅能夠獲取二維切片的圖像而且能夠?qū)⒍伣M織結(jié)構(gòu)立體化，能夠更加直觀的對(duì)其觀察。

2.2.5耳蝸整體三維成像法近年有部分學(xué)者應(yīng)用共聚焦顯微鏡聯(lián)合電腦輔助軟件，制作完整耳蝸的三維立體結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行內(nèi)耳相關(guān)研究。Wrzeszcz等[34]將整個(gè)豚鼠耳蝸經(jīng)固定，漂洗，脫鈣，梯度酒精脫水，MSBB浸泡過(guò)夜處理之后，利用激光共聚焦顯微鏡(laser imaging microscopy，CLSM，LSCM)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描攝片，由頂回至底回逐層掃描，整個(gè)過(guò)程需耗時(shí)3～4個(gè)小時(shí)，將拍攝圖像傳入與之相連的計(jì)算機(jī)，利用XuvTool軟件對(duì)重疊部位進(jìn)行處理，將其處理為一個(gè)完整的三維中軸圖像，可以將蝸軸進(jìn)行360°旋轉(zhuǎn)觀察，制成的圖像以圖片或視頻方式輸出保存，利用專門(mén)計(jì)數(shù)胞核的ITCNplug-in軟件對(duì)SGCs計(jì)數(shù)。Johnson等[24]將整個(gè)貓的耳蝸進(jìn)行熒光染色，利用薄層激光成像顯微鏡(thin layer of laser imaging microscopy，TSLIM)拍攝從頂回至底回的耳蝸圖片，再利用專門(mén)的軟件分析整合為一個(gè)立體的耳蝸圖，可以計(jì)數(shù)總的SGCs，并可對(duì)每個(gè)距離長(zhǎng)度的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以更加詳細(xì)的了解耳蝸每個(gè)部位SGCs具體數(shù)目并進(jìn)行比較分析。Schmitz等[11]利用TSLIM觀察藥物性聾小鼠的耳蝸結(jié)構(gòu)，在1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm的像素下，按B樣曲線模式(電腦輔助設(shè)計(jì)軟件中用于決定幾個(gè)點(diǎn)之間的曲線走行及曲線弧度的一種數(shù)學(xué)表示法)沿基底膜從底部到頂部掃描2次，一次是myosin VIIa染色后，一次是異硫氰酸羅丹明B染色之后；圖像經(jīng)Amira軟件處理將耳蝸整體結(jié)構(gòu)重建之后，觀察毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、大小、損傷的具體部位以及整個(gè)耳蝸組織細(xì)胞的三維形態(tài)。該法能夠使細(xì)胞更形象，更易辨認(rèn)，計(jì)數(shù)更精確，尤其是將細(xì)胞適當(dāng)?shù)娜旧?，能夠在幾乎不損傷組織結(jié)構(gòu)的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)，形象的展示耳蝸組織細(xì)胞的空間位置及形態(tài)特征，增加人們對(duì)耳蝸的立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，是一種比較理想的計(jì)數(shù)方法。

在各類理化因素的影響下，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可出現(xiàn)不同程度的退行性變，觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化及計(jì)數(shù)能夠?qū)ζ鋼p傷定性及定量。目前，單純鏡下計(jì)數(shù)法已較少應(yīng)用；對(duì)耳蝸超薄切片進(jìn)行圖片分析聯(lián)合相關(guān)的細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法因其簡(jiǎn)單、省時(shí)，目前應(yīng)用較廣；三維立體重建法能夠清楚地呈現(xiàn)耳蝸立體空間結(jié)構(gòu)及局部組織細(xì)胞的形態(tài)特征，并且可以精確的定量分析，但因其對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件，如：儀器設(shè)備以及輔助軟件的要求較高，目前應(yīng)用還比較少。因此，綜合分析這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，從中選擇一個(gè)簡(jiǎn)單而又精確的方法觀察并計(jì)數(shù)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，將為以后實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考依據(jù)。

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(2015-04-07收稿)

(本文編輯雷培香)

【中圖分類號(hào)】R322.9+23

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)02-0203-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.023

通訊作者：張志遠(yuǎn)(Email：zzyent@126.com)

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(南昌330006)；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科