張立偉　劉芳芳　于利　王愛梅

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·實驗研究·

順鉑對離體培養(yǎng)小鼠耳蝸毛細(xì)胞鈣蛋白酶表達(dá)的影響*

張立偉1劉芳芳1于利1王愛梅1

【摘要】目的觀察順鉑對離體培養(yǎng)小鼠耳蝸毛細(xì)胞鈣蛋白酶(calpain)表達(dá)的影響，探討順鉑致耳蝸毛細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只(600耳)，分離出耳蝸基底膜600條，體外培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對照組和4、8、16 μg/ml順鉑組，每組150條；對照組加入2ml新鮮培養(yǎng)基，順鉑組分別加入2 ml含不同濃度順鉑(4、8、16 μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用Hoechst 33258熒光染色觀察耳蝸毛細(xì)胞凋亡情況，并應(yīng)用免疫熒光染色和免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測calpain 1(μ-calpain)和calpain 2(m-calpain)在耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果4、8、16 μg/ml順鉑組耳蝸毛細(xì)胞凋亡率分別為15.63%±0.20%、38.40%±2.64%和64.24%±0.05%，均高于對照組(5.55%±0.12%)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系；不同濃度順鉑組μ-calpain和m-calpain的表達(dá)均較對照組明顯增強(qiáng)(P<0.01)，且m-calpain的表達(dá)隨順鉑濃度的增高而明顯增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論順鉑可通過calpain通路誘導(dǎo)小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮毒性效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】順鉑；耳蝸；毛細(xì)胞；鈣蛋白酶；小鼠

鈣蛋白酶(calpain)為一種鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶，可參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡與壞死等多種生理病理過程[1]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的calpain主要以無活性的酶原形式存在，僅少部分被激活，以維持機(jī)體的正常活動；在病理狀態(tài)下，鈣離子濃度的異常增高可持續(xù)激活calpain，進(jìn)而降解細(xì)胞骨架、膜蛋白以及各種激酶和轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。文獻(xiàn)報道，在體情況下，順鉑導(dǎo)致成年BALB/c小鼠聽功能下降的同時伴耳蝸calpain的高表達(dá)，提示calpain介導(dǎo)了順鉑對成年BALB/c小鼠的耳毒性損傷[2]。在離體情況下，順鉑是否也能誘導(dǎo)耳蝸calpain的高表達(dá)目前為止尚不明確。因此，本研究擬通過觀察順鉑對離體培養(yǎng)小鼠耳蝸毛細(xì)胞calpain表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討順鉑的耳毒性機(jī)制及其防護(hù)提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料實驗動物為生后3 d的健康昆明小鼠300只(600耳)，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；順鉑和牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，Hoechst 33258購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗calpain 1(μ-calpain)和抗calpain 2 (m-calpain)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Mini-PROTEAN電泳儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，MCO-15A型CO2培養(yǎng)箱由日本SANYO公司生產(chǎn)，Zeiss-A1顯微鏡由德國Zeiss公司生產(chǎn)EDAS290凝膠成像分析系統(tǒng)由日本Kodak公司生產(chǎn)。

1.2實驗方法

1.2.1分離小鼠耳蝸基底膜將全身消毒后的小鼠斷頭，用剪刀沿矢狀縫剪開顱骨，去除腦組織以充分暴露顱底。體視顯微鏡下分離出整個耳蝸，移入預(yù)冷的Hanks液中。打開耳蝸殼，依次剝離螺旋韌帶、血管紋及前庭膜，將基底膜沿蝸軸完整分離，共分離出600條耳蝸基底膜。

1.2.2小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)將10 μl膠原凝膠液滴在培養(yǎng)皿中，室溫下放置15～20 min使其凝固。然后加入1 ml無血清培養(yǎng)基。將分離后的基底膜移入培養(yǎng)皿中，再逐漸沿膠滴邊緣將基底膜正面朝上平鋪到膠滴表面。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，再加入1 ml培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基完全覆蓋膠滴，然后放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3實驗分組及離體順鉑耳毒性模型制備24 h后，棄去原培養(yǎng)基，將基底膜隨機(jī)分為對照組和4、8、16 μg/ml順鉑組，每組150條。對照組加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，其余3組分別加入2 ml含有不同濃度順鉑(4 μg/ml、8 μg/ml和16 μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每組隨機(jī)取10條基底膜用于進(jìn)行Hoechst 33258熒光染色以觀察毛細(xì)胞凋亡，10條基底膜用于進(jìn)行μ-calpain的免疫熒光染色，10條基底膜用于進(jìn)行m-calpain的免疫熒光染色，其余的120條基底膜每20條基底膜合為一份標(biāo)本，每組共6份標(biāo)本，于-80 ℃冰箱中保存，分別用于進(jìn)行μ-calpain和m-calpain的Western blot檢測。

1.2.4Hoechst 33258熒光染色和耳蝸凋亡毛細(xì)胞計數(shù)終止實驗時吸出培養(yǎng)基，PBS漂洗后加入4 %多聚甲醛，4 ℃下固定過夜。次日PBS 漂洗，然后向培養(yǎng)皿中加入0.3 % TritonX-100溶液室溫下作用30 min。傾去Triton X-100溶液后，PBS 漂洗，然后加入Hoechst 33258(2.5 μg/ml)室溫下避光染色10 min。PBS 漂洗后，將帶有基底膜的膠粒移至滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

各組在熒光顯微鏡下，從耳蝸基底膜底端向頂端(不考慮基底膜長度)選取200個毛細(xì)胞，計數(shù)其中凋亡的毛細(xì)胞個數(shù)(細(xì)胞核呈高亮狀態(tài)、出現(xiàn)核固縮、核碎裂的毛細(xì)胞判定為凋亡毛細(xì)胞)，并計算毛細(xì)胞凋亡百分率(毛細(xì)胞凋亡率=凋亡毛細(xì)胞數(shù)/200×100%)。

1.2.5calpain免疫熒光染色終止實驗時吸出培養(yǎng)基，PBS 漂洗后加入4 %多聚甲醛，4 ℃下固定過夜。次日PBS 漂洗，然后向培養(yǎng)皿中加入0.3 % TritonX-100溶液室溫下作用30 min。傾去Triton X-100溶液后，PBS 漂洗，然后加入10 %山羊血清，37 ℃下孵育30 min。滴加抗μ-calpain或抗m-calpain抗體(均1:100稀釋)，4 ℃下過夜。次日，PBS漂洗后，滴加TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃下避光孵育30 min。PBS漂洗后，將帶有基底膜的膠粒移至滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，蓋上蓋玻片。熒光顯微鏡下觀察耳蝸毛細(xì)胞calpain的表達(dá)情況并拍照。

1.2.6calpain免疫印跡(Westen blot)檢測于離心管中加入RIPA裂解液，0 ℃下超聲粉碎，4 ℃下離心25 min(12000轉(zhuǎn)/min)。取上清并測定蛋白含量。灌膠后每條泳道加入80 μg蛋白樣品，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，再加入5 %脫脂奶粉溶液中，4 ℃下?lián)u床孵育1 h后，加入抗μ-calpain或抗m-calpain抗體(均1:1000稀釋)，4 ℃下過夜。TBST緩沖液沖洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1: 1000稀釋)，4 ℃下?lián)u床孵育1 h。TBST緩沖液沖洗后滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，曝光、顯影后得到電泳條帶。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)測定各電泳條帶的灰度值。β-actin作為內(nèi)參照物，以calpain/β-actin比值代表calpain的蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及SNK檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞的凋亡比較經(jīng)Hoechst 33258染色后，對照組小鼠耳蝸毛細(xì)胞核多呈淡藍(lán)色，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻(圖1a)；而不同濃度順鉑組小鼠耳蝸毛細(xì)胞核則出現(xiàn)固縮，呈亮藍(lán)色，核內(nèi)染色質(zhì)邊集；并且隨著順鉑濃度的增高，致密濃染的細(xì)胞核亦顯著增多(圖1b～1d)。耳蝸凋亡毛細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，對照組小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡率為5.55%±0.12%，而不同濃度順鉑組耳蝸毛細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性增大，與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

2.2各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞calpain表達(dá)比較

2.2.1calpain免疫熒光染色結(jié)果熒光顯微鏡下觀察，可見μ-calpain和m-calpain在對照組小鼠耳蝸毛細(xì)胞均呈微弱紅色熒光(圖2a、3a)；不同濃度順鉑組小鼠耳蝸毛細(xì)胞μ-calpain和m-calpain紅色熒光均較對照組有所增強(qiáng)，但不同濃度順鉑組間μ-calpain熒光強(qiáng)度基本相同(圖2b～2d)，而m-calpain熒光則隨順鉑濃度的增高而明顯增強(qiáng)(圖3b～3d)。

2.2.2calpain免疫印跡(Westen blot)檢測結(jié)果對照組出現(xiàn)較弱的μ-calpain和m-calpain電泳條帶；不同濃度順鉑組μ-calpain和m-calpain電泳條帶均明顯加深(圖4)。電泳條帶密度分析結(jié)果顯示，不同濃度順鉑組μ-calpain/β-actin比值和m-calpain/β-actin比值均較對照組明顯增大(P<0.01)，即μ-calpain和m-calpain表達(dá)顯著增強(qiáng)，但順鉑組間μ-calpain表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，而m-calpain的表達(dá)則隨順鉑濃度的增高而明顯增強(qiáng)(P<0.01)(表2)。

圖1　各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡的Hoechst 33258檢測(×400)

圖2　各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞μ-calpain的表達(dá)(免疫熒光染色×400)

a.對照組；b.4 μg/ml順鉑組；c.8 μg/ml順鉑組；d.16 μg/ml順鉑組。對照組熒光較弱，而不同濃度順鉑組熒光較對照組明顯增強(qiáng)，但順鉑組間熒光強(qiáng)度無明顯差異

圖3　各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞m-calpain的表達(dá)(免疫熒光染色×400)

a.對照組；b.4 μg/ml順鉑組；c.8 μg/ml順鉑組；d.16 μg/ml順鉑組。對照組熒光較弱，而不同濃度順鉑組熒光明顯強(qiáng)于對照組，并且隨著順鉑濃度的增高而顯著增強(qiáng)

圖4　各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞μ-calpain和m-calpain的電泳條帶

組別毛細(xì)胞凋亡率對照組5.55±0.124μg/ml順鉑組15.63±0.20*8μg/ml順鉑組38.40±2.64*#16μg/ml順鉑組64.24±0.05*#▲

注：*與對照組比較，P<0.01；#與4 μg/ml順鉑組比較，P<0.01；▲與8 μg/ml順鉑組比較，P<0.01

表2　各組離體小鼠耳蝸毛細(xì)胞μ-calpain/β-actin和

注：*與對照組比較，P<0.01；#與4 μg/ml順鉑組比較，P<0.01；▲與8 μg/ml順鉑組比較，P<0.01

3討論

calpain是一種依賴鈣離子激活的中性半胱氨酸蛋白酶，該酶主要包括兩種同分異構(gòu)體，即calpain 1和calpain 2。calpain 1只需微摩爾濃度的鈣離子就可被激活，故又稱μ-calpain；而calpain 2則需毫摩爾濃度的鈣離子才能被激活，故又稱m-calpain。正常時細(xì)胞內(nèi)calpain主要以無活性的酶原形式存在，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度異常升高后，酶原N末端肽鍵發(fā)生自溶性斷裂而被活化。活化的calpain可對多種細(xì)胞骨架蛋白、離子通道和與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的G蛋白及酶等產(chǎn)生降解作用，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶的功能，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[3]。

近年來的研究表明，多種耳毒性藥物所致的內(nèi)耳細(xì)胞凋亡都與calpain有關(guān)[4～8]。Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)卡那霉素處理后，小鼠耳蝸細(xì)胞發(fā)生了凋亡，同時伴有calpain的高表達(dá)，提示calpain參與了卡那霉素所致小鼠耳蝸細(xì)胞凋亡。Chang等[2]觀察到成年小鼠腹腔注射不同劑量順鉑5 d后，小鼠ABR閾移明顯增大，與此同時耳蝸毛細(xì)胞中μ-calpain和m-calpain的表達(dá)較正常對照組明顯增強(qiáng)，并且隨著順鉑給藥劑量的增大，m-calpain的表達(dá)亦逐漸增強(qiáng)，表明calpain也介導(dǎo)了順鉑對小鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷，該結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。本研究將不同濃度順鉑作用于離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸基底膜24 h后，觀察到凋亡毛細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多，并且隨著順鉑濃度的逐漸增高，毛細(xì)胞凋亡率顯著增大；同時順鉑組μ-calpain和m-calpain的表達(dá)亦較對照組明顯增強(qiáng)，由此提示在離體情況下，順鉑也能誘導(dǎo)小鼠耳蝸calpain的高表達(dá)，使毛細(xì)胞凋亡增多。此外，本研究還觀察到μ-calpain的表達(dá)并不隨順鉑濃度的增高而增強(qiáng)，提示μ-calpain可能在順鉑誘導(dǎo)小鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡的過程中不起主要作用。

目前，關(guān)于活化的calpain進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全清楚，一般認(rèn)為通過以下兩條途徑：① 線粒體途徑：細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高時可使calpain被激活，活化的calpain能切割細(xì)胞漿中的凋亡蛋白Bid，使其活化；Bid通過與位于線粒體的跨膜蛋白Bak結(jié)合，使Bak構(gòu)象發(fā)生變化，形成孔隙，從而使線粒體外膜的滲透性增加，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放出來，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；② 蛋白水解途徑：calpain過度活動可降解細(xì)胞骨架蛋白、血影蛋白、鈣調(diào)蛋白激酶和ADP核糖轉(zhuǎn)移酶等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。至于在本研究中，calpain 是否通過上述機(jī)制導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞凋亡，有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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4Yu L, Tang H, Jiang XH, et al. Involvement of calpain-I and microRNA34 in kanamycin-induced apoptosis of inner ear cells [J]. Cell Biol Int, 2010, 34: 1219.

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9王蘋, 杜波, 杜寶東. 鈣蛋白酶活性及其誘導(dǎo)內(nèi)耳細(xì)胞死亡[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2006, 30: 354.

(2015-05-04收稿)

(本文編輯雷培香)

The Effects of Cisplatin on the Expression of Calpain in Mouse Cochlear Hair Cell in Vitro

Zhang Liwei, Liu Fangfang, Yu Li, Wang Aimei

(Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou, 121001, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of cisplatin on the expression of calpain in mouse cochlear hair cells in vitro, and to explore the mechanism of cisplatin-induced apoptosis in mouse cochlear hair cells. MethodsA total of 600 cochlear basilar membranes isolated from Kunming mice at postnatal day 3 were cultured for 24 hours, then randomly divided into control group and 3 cisplatin groups (4 μg/ml, 8 μg/ml and 16 μg/ml). Each group contained 150 basilar membranes. Four groups were continually cultured for another 24 hours. Hoechst 33258 staining was used to detect the apoptosis of cochlear hair cell. Immunofluorescent staining and Western blot were carried out for detecting the expressions of calpain 1 (μ-calpain) and calpain 2 (m-calpain) in mouse cochlear hair cells. ResultsThe percent of apoptotic hair cells in the three cisplatin groups (15.63%±0.20%, 38.40%±2.64% and 64.24%±0.05%, respectively) was greater than that of in the control group (5.55%±0.12%), showing a clear dose-response relationship (P<0.01). Furthermore, the expressions of μ-calpain and m-calpain in different cisplatin groups were increased, and m-calpain expression was great remarkably with increased concentration of cisplatin (P<0.01).ConclusionOur results suggest that cisplatin can induce the apoptosis in mouse cochlear hair cells by regulating calpain pathway. This may play a role in the cisplatin-induced ototoxicity.

【Key words】Cisplatin；Cochlea；Hair cell；Calpain；Mouse

【中圖分類號】R764.43

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)02-0167-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.014

作者簡介：張立偉，男，黑龍江人，碩士研究生，研究方向為聽覺生理與病理。通訊作者：王愛梅(Email: aimeiwang88@163.com)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-12-2815：12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20151228.1512.012.html

*遼寧省自然科學(xué)基金(2014022029)資助

1遼寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室(錦州121001)