南京曉莊學(xué)院 郭云鸝 俞淑芳 張鳳紅 周紅霞＊

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品市場(chǎng)不斷拓展，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品商品化。轉(zhuǎn)基因生物（GMO）抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本相對(duì)較低，具有較好的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)性和應(yīng)用前景。但轉(zhuǎn)基因生物的廣泛應(yīng)用是否會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類及其他生物的健康造成不良影響，至今仍無(wú)定論（金蕪軍等，2004）。PCR技術(shù)手段由于其高效性而成為轉(zhuǎn)基因食品的最常用檢測(cè)方法。國(guó)際通用方法是以PCR技術(shù)為平臺(tái)，通過(guò)特異擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因調(diào)控原件花椰菜花葉病毒（CaMV35S）啟動(dòng)子、脂肪堿合酶 （NOS）終止子以及目的基因抗除草劑基因Cp4-EPSPS來(lái)篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品 （Su等，2003）。本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因大豆為原料，采用CTAB法從中提取了基因組DNA。設(shè)計(jì)并合成引物對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因Lectin，外源基因CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Cp4 EPSPS基因進(jìn)行檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因大豆及產(chǎn)品的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 轉(zhuǎn)基因大豆，由南京農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供；非轉(zhuǎn)基因大豆為東北大豆。

1.2 儀器與試劑 PCR儀 （Biomera TGRADIENT）、Y04S-C型凝膠成像分析系統(tǒng)；CTAB緩沖液、酚、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、70%乙醇、TE溶液、RNA酶溶液 （購(gòu)自南京天為生物科技有限公司）、異丙醇、10×PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂 （25 mmol/L）、dNTP 溶 液 （2.5 mmol/L）、引 物（自行設(shè)計(jì)，由南京金瑞斯生物科技有限公司提供）、Taq 酶（5 U/μL）、Maker（購(gòu)自寶生物工程有限公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) 《大豆轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)方法（SN/T 1195-2003）》設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)基因大豆的Lectin內(nèi)標(biāo)基因、CaMV35S啟動(dòng)子基因、NOS終止子基因、Cp4 EPSPS基因的引物序列（表1）， 基因檢測(cè)片段的長(zhǎng)度分別為118、195、180 bp和320 bp（Zhang 等，2007；程紅梅等，2007）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大豆DNA的提取 采用CTAB提取法，分別稱取100 mg試樣在液氮中充分研磨成粉狀至

1.5 mL離心管中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。加入600 μL CTAB緩沖液，振蕩均勻，65℃溫育30 min。加入500 μL 酚+三氯甲烷+異戊烷（25∶24∶1，V/V/V），振蕩均勻，12000 r/min離心15 min。吸取上清液，放入另一新管中，加入等體積的異丙醇，12000 r/min離心10 min。棄去上清夜，加入70%乙醇溶液洗滌，12000 r/min離心1 min。棄去上清夜，干燥，用50 μL TE溶液溶解沉淀。加入5 μL RNA酶溶液，37℃溫育30 min。加入400 μL的CTAB溶液，振蕩均勻。加入 250 μL 的三氯甲烷+異戊烷（24∶1，V/V），振蕩均勻，12000 r/min離心 15 min。吸取上清液，放入另一新管中，加入200 μL的異丙醇，12000 r/min離心10 min。棄去上清液，干燥，用50 μL TE溶液溶解沉淀即為大豆DNA提取液（金紅等，2006）。

表1 引物序列與擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4.2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl 22.5 μL，dNTP 2.5 mmol/L 2.0 μL，20 pmol/μL 引物 （正：0.25 μL， 反：0.25 μL），5 U/μL Taq 酶 0.125 μL，DNA模板取量為0.6 μL，所補(bǔ)超純水量隨DNA模板量而變化，最終補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件見表2，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。

表2 PCR反應(yīng)條件

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為1×TAE電泳緩沖液，以5 V/cm電壓中電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆的DNA電泳圖 將提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆均有明顯條帶，純度較高，可用于 PCR 擴(kuò)增（Zhang等，2007）。

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆的DNA電泳圖

2.2 大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測(cè) Lectin基因是大豆所特有的內(nèi)源性基因，檢測(cè)內(nèi)源基因可以判斷所提取的DNA是否適合用于PCR擴(kuò)增，同時(shí)還可以判斷所提取的DNA是否含有PCR擴(kuò)增抑制物，從而避免結(jié)果出現(xiàn)假陰性。按表2的PCR反應(yīng)條件首先檢測(cè)了Lectin基因，以水代替DNA模板作為空白對(duì)照。圖2為大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測(cè)結(jié)果。由圖2可見，轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆均能擴(kuò)增出118 bp片段，說(shuō)明所提取的DNA質(zhì)量較好，可用作PCR檢測(cè)模板。

圖2 內(nèi)源基因Lectin的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 大豆食用油中外源基因檢測(cè)結(jié)果 外源基因的檢測(cè)通常包括兩方面：一是調(diào)控基因的檢測(cè)；二是目的基因的檢測(cè)。首先對(duì)調(diào)控基因CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子按表2的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，以水代替DNA模板作為空白對(duì)照，結(jié)果見圖3和圖4。從圖3和圖4可見，轉(zhuǎn)基因大豆能擴(kuò)增出 195 bp的CaMV35S啟動(dòng)子和180 bp的NOS終止子片段，而非轉(zhuǎn)基因大豆未擴(kuò)增出這兩個(gè)基因（程紅梅等，2007）。

圖3 CaMV35S啟動(dòng)子基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 NOS終止子基因擴(kuò)增結(jié)果

由于CaMV35S啟動(dòng)子來(lái)源于花椰菜花葉病毒，NOS終止子來(lái)源于根際的農(nóng)桿菌，因此若原料大豆被花椰菜花葉病毒或被根瘤膿桿菌侵染，檢測(cè)就會(huì)有假陽(yáng)性出現(xiàn)。因此，除了檢測(cè)調(diào)控基因，還要檢測(cè)目的基因 Cp4-EPSPS（Zhang，2007）。Cp4-EPSPS基因的檢測(cè)結(jié)果見圖5。由圖5可見，轉(zhuǎn)基因大豆所提取的DNA可以成功檢測(cè)到目的基因Cp4-EPSPS 320bp片段，而非轉(zhuǎn)基因大豆和空白對(duì)照均未檢測(cè)出該片段。

圖5 轉(zhuǎn)基因大豆Cp4 EPSPS基因擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了轉(zhuǎn)基因大豆定性PCR檢測(cè)體系，該方法所檢測(cè)的CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cp4-EPSPS等基本覆蓋了目前已商品化的轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品，基本滿足各國(guó)家和地區(qū)轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的定性檢測(cè)。

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