摘 要 昆蟲(chóng)中腸消化液中含有種類繁雜的蛋白酶，它們?cè)谑澄锵?、免疫反?yīng)等方面發(fā)揮著復(fù)雜且重要的作用。在昆蟲(chóng)生理過(guò)程中，蛋白代謝的開(kāi)始階段，蛋白酶能水解蛋白質(zhì)成為多肽，成為中腸水解蛋白酶。類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine proteases，Tryp_SPs）是一類真核生物體中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的絲氨酸蛋白酶分子，它行使著很多功能，如食物消化、止血、免疫防衛(wèi)響應(yīng)和神經(jīng)響應(yīng)等。

關(guān)鍵詞 昆蟲(chóng)；中腸蛋白酶；絲氨酸蛋白酶；類胰蛋白酶；進(jìn)化；分子遺傳學(xué)

中圖分類號(hào)：Q966；Q556；Q75 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.31.014

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昆蟲(chóng)中腸消化液中存在的各種酶種類繁雜，起消化食物的作用，其中分解食物中的蛋白質(zhì)的蛋白酶稱為昆蟲(chóng)中腸蛋白酶。目前已知的蛋白酶的分類如下：絲氨酸蛋白酶（Serine proteases）、蘇氨酸蛋白酶（Threonine proteases）、半胱氨酸蛋白酶（Cysteine proteases）、天冬氨酸蛋白酶（Aspartic acid proteases）、金屬蛋白酶（Metalloproteases）和谷氨酸蛋白酶（Glutamic acid proteases）。昆蟲(chóng)中腸蛋白酶大多數(shù)都是一種催化化學(xué)鍵的水解的水解酶。昆蟲(chóng)消化酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶、組織蛋白酶和彈性蛋白酶。中腸的主要蛋白酶是類胰蛋白酶，也是一種絲氨酸蛋白酶。在Heliothis virescens[1]、Mamestra brassicae[2]、Creontiades dilutus[3]、Busseola fusca[4]、Achaea janata[5]、Mosquito[6]和Lutzomyia longipalpis[7] 等昆蟲(chóng)中鑒定出了Tryp_SPs家族。

1絲氨酸蛋白酶系列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在昆蟲(chóng)中腸中，絲氨酸蛋白酶（Serine Proteases，SP）是一種主要的蛋白酶家族，它們作為酶類參與各種生理生化途徑過(guò)程。絲氨酸蛋白酶的作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。其原理是首先通過(guò)鄰近的氨基酸殘基鏈激活活性中心的絲氨酸殘基，被激活的羥基與肽鍵的碳原子發(fā)生親核反應(yīng)，從而發(fā)生水解反應(yīng)使得肽鍵斷裂；其次是肽鍵斷裂后，酰基上的碳被酯化，肽鍵的氮端部分被釋放游離。在鱗翅目昆蟲(chóng)中腸中，絲氨酸蛋白酶是一類主要的蛋白酶，它們是中腸蛋白酶主要的活性成員[8]。絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上為全β蛋白，核心結(jié)構(gòu)由2個(gè)非常相似的結(jié)構(gòu)域（N 結(jié)構(gòu)域和C 結(jié)構(gòu)域）構(gòu)成。由于2個(gè)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上存在著差異，它們?cè)诠δ芎瓦M(jìn)化上的作用也就不同。絲氨酸蛋白酶催化中心的3個(gè)主要?dú)埢芯陀?個(gè)（Asp 102 His 57） 位于N端結(jié)構(gòu)域，但是最重要的Ser 195 卻在C端結(jié)構(gòu)域上，且其他重要的功能位點(diǎn)都位于C端結(jié)構(gòu)域，其中包括穩(wěn)定催化中間產(chǎn)物的氧離子孔（Gly 193 Ser 195），底物特異性口袋（ Ser 189、Gly 216 Gly 226），主鏈底物結(jié)合位點(diǎn)（Ser 214，Trp 215 Gly216）。C端結(jié)構(gòu)域還含有2個(gè)十分重要的保守二硫鍵，C端結(jié)構(gòu)域上包含了絕大部分的功能位點(diǎn)，因此C端結(jié)構(gòu)域執(zhí)行絲氨酸蛋白酶的主要催化功能；而N端結(jié)構(gòu)域的主要功能則可能是同C端結(jié)構(gòu)域配合，從而保證催化中心三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能活性[9]。

1.2Clip-domain_SPs、Tryp_SPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Clip-domain_SPs是絲氨酸蛋白酶的一種，在氨基酸序列中有一個(gè)37～55個(gè)的基序（motif），這段序列特點(diǎn)是富含半胱氨酸。6個(gè)半胱氨酸保守殘基在空間結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)類似2張紙一樣的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因此這類絲氨酸蛋白酶叫做Clip-domain_SPs。類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine proteases，Tryp_SPs）是一類真核生物體中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的絲氨酸蛋白酶，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防衛(wèi)響應(yīng)和神經(jīng)響應(yīng)在內(nèi)的功能。它們擁有一系列肽活性，如外肽酶、內(nèi)肽酶、低聚肽和Ω-肽活性?；谛蛄邢嗨菩院凸δ荜P(guān)系把SP歸為20個(gè)家族（S1～S66），通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)其中很多屬于無(wú)根進(jìn)化關(guān)系。不考慮它們的進(jìn)化起源，我們發(fā)現(xiàn)其中有些肽的分子機(jī)制是相似的。胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和羧肽酶C有著相同的活性氨基酸：絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸。在生化反應(yīng)中，絲氨酸作為親核基團(tuán)，天冬氨酸作為親電基團(tuán)，組氨酸作為一個(gè)基本基團(tuán)，分別參與到分子過(guò)程中去。盡管在分子活性基團(tuán)有差別，但是從蛋白分子結(jié)構(gòu)相似上來(lái)說(shuō)仍然有著相似性，例如在胰凝乳蛋白酶亞家族中的活性三聯(lián)體是HDS，在枯草桿菌蛋白酶家族中的活性三聯(lián)體是DHS，但在羧肽酶C中活性三聯(lián)體是SDH。

2蚊子中的類胰蛋白酶家族的消化研究及其在進(jìn)化中的作用

2.1寄主和寄生蟲(chóng)間胰蛋白酶的消化作用

蚊子是傳播人類寄生蟲(chóng)病和病毒病的主要媒介，主要傳播瘧疾、絲蟲(chóng)病、骨痛熱病和黃熱熱病等，這些疾病對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。阻止病原的傳播成為控制疾病的重要手段。當(dāng)前，人類已經(jīng)獲得岡比亞按蚊、致倦庫(kù)蚊、埃及伊蚊的基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)這些基因組數(shù)據(jù)制訂相應(yīng)的措施來(lái)研究病蟲(chóng)的傳播機(jī)制是目前一項(xiàng)熱門(mén)手段。血液是雌蚊完成生殖成熟周期的重要營(yíng)養(yǎng)成分，它促使雌蚊正常產(chǎn)卵和合成卵黃蛋白。因此，對(duì)于血液性寄生害蟲(chóng)的遺傳機(jī)制的研究有助于控制病蟲(chóng)害的傳播。之前的比較基因組學(xué)表明這些物種間的相關(guān)基因呈現(xiàn)出突出的適應(yīng)性、動(dòng)態(tài)化和多樣化。

絲氨酸蛋白酶在生理過(guò)程中扮演著重要的作用：例如對(duì)于蛋白前體的活性剪切來(lái)激活成活體來(lái)行使相應(yīng)分子功能。類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一類真核生物體中普遍存在的含有胰蛋白酶催化功能域的分子，它行使很多包括食物消化、止血、免疫防衛(wèi)響應(yīng)和神經(jīng)響應(yīng)在內(nèi)的功能。在蚊子中，2類類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）在食物消化中的生理功能已經(jīng)被詳盡的闡述。岡比亞按蚊基因組中含有7個(gè)胰蛋白酶基因，它們聚類地位于染色體3R一個(gè)11 kb大小的區(qū)域中，其中已知5個(gè)基因編碼功能蛋白。那么血液寄生蟲(chóng)和寄主間，這類蛋白酶扮演著什么樣的功能呢？目前，人們推測(cè)：在寄主體內(nèi)的寄生蟲(chóng)編碼幾丁質(zhì)蛋白，寄主的絲氨酸蛋白酶通過(guò)激活幾丁質(zhì)蛋白來(lái)增強(qiáng)中腸圍食膜的通透性，從而使得寄生蟲(chóng)在體內(nèi)能夠運(yùn)輸，進(jìn)而提高生存率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，給蚊子喂食絲氨酸蛋白酶抑制劑后寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)滯育顯著加強(qiáng)，已經(jīng)在岡比亞按蚊基因組中發(fā)現(xiàn)3個(gè)胰凝乳蛋白酶基因。

2.2蛋白酶的進(jìn)化研究

2.2.1 遺傳中蛋白酶家族大小的變化與進(jìn)化的關(guān)系

人們推測(cè)在環(huán)境選擇壓力下基因功能趨于專一化，那么Tryp_SPc家族在基因家族的成員數(shù)量的大小和復(fù)雜度上也應(yīng)該體現(xiàn)增大現(xiàn)象。例如，在岡比亞按蚊、黑腹果蠅、人和紅鰭河豚魚(yú)的蛋白組研究鑒定出Tryp_SPc家族各305， 206， 110， 125個(gè)功能基因。相比較而言，在秀麗隱桿線蟲(chóng)蛋白組中只鑒定出13個(gè)Tryp_SPc基因。相對(duì)非脊椎動(dòng)物而言，脊椎動(dòng)物的Tryp_SPc蛋白結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，這些蛋白不僅包括Tryp_SPc的功能域，而且還包括其他的功能域。在功能上，Tryp_SPc家族的大小在各物種起到不同的作用。在非脊椎動(dòng)物中，絲氨酸蛋白酶在消化、血淋巴凝固、黑色素形成、抗微生物肽合成起到重要作用，同時(shí)也能激活寄主快速免疫途徑。Tryp_SPc在消化系統(tǒng)中的作用很復(fù)雜，扮演著各種各樣的角色。

為了解Tryp_SPc的作用（特別是對(duì)血液寄生蟲(chóng)的作用），首先要根據(jù)物種的基因組序列，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定出所有Tryp_SPc成員，并在基因組水平上研究蚊子吸血前和吸血后的蛋白酶的含量變化，進(jìn)而研究它們的分子復(fù)雜性和進(jìn)化關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，成員增多亞家族成員表達(dá)量增加更加顯著。岡比亞按蚊、埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊和黑腹果蠅相比較，Tryp_SPc家族成員數(shù)量分別增加32.7%、46%、55%。雖然蚊子和果蠅家族成員大小有很大的區(qū)別，但是蚊子中間的差別更小，這表明：蚊子種間Tryp_SPc家族成員數(shù)量大小和功能從種間分化開(kāi)始是保守的。進(jìn)化樹(shù)表明，在蚊子的種間分化前有很多成員是共有的，并在分化過(guò)程中形成了很多特有的成員[6]（Wu，Wang et al. 2009）。以上研究表明，Tryp_SPc基因的增加是蚊子進(jìn)化中的一種適應(yīng)機(jī)制，并且有可能由獲得寄生蟲(chóng)后誘發(fā)的機(jī)制。

2.2.2 表達(dá)水平和在染色體中的分布研究

功能確定的基因趨于復(fù)制和擁有更高的進(jìn)化速率，基因成員數(shù)量和表達(dá)量的增加和新的生物學(xué)功能相關(guān)[10]；在動(dòng)態(tài)選擇壓力下，功能和進(jìn)化穩(wěn)定性之間在遺傳上密切相關(guān)[11-12]。蚊子吸血過(guò)后，Tryp_SPc家族成員組成數(shù)量上大體增加，基因表達(dá)水平也提高了。在岡比亞按蚊中，特有基因在吸血前后，表達(dá)量顯著上升。在岡比亞按蚊基因組中Tryp_SPc基因在染色體中是串聯(lián)聚類，串聯(lián)基因復(fù)制在Tryp_SPc的增多上有著重要的作用[6]。

2.2.3 蛋白酶的正向選擇及三維結(jié)構(gòu)分析

適應(yīng)性進(jìn)化中，有些基因趨向特異基因，從而使得家族成員增多，正向選擇是這一機(jī)制的主要?jiǎng)恿?。?duì)于吸血之后誘導(dǎo)特異基因和水平顯著增加的基因，計(jì)算它們的dN/dS值，得到比值大于1，說(shuō)明Tryp_SPc在進(jìn)化過(guò)程中是正向選擇，進(jìn)而說(shuō)明了適應(yīng)進(jìn)化使得血液寄生蟲(chóng)能夠適應(yīng)外源血液。

構(gòu)建三維分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)活性選擇性殘基在分子結(jié)構(gòu)的表面，并且包括與絲氨酸蛋白酶抑制劑相結(jié)合的活性位點(diǎn)，因此認(rèn)為活性選擇位點(diǎn)對(duì)于Tryp_SPc與血液的消化起著至關(guān)重要的作用。

3 Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的研究進(jìn)展

3.1CLIP-domain SPs在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用

The CLIP-domain SPs參與到昆蟲(chóng)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。在昆蟲(chóng)受到真菌或者細(xì)菌感染過(guò)程中，CLIP-domain SP Persephone中的活性部分激活CLIP Spatzle途徑中酶（SPE），SPE激活Pro-Spatzle；前提Spatzle結(jié)合到Toll受體，然后激發(fā)Toll途徑；Toll受體結(jié)合后激活A(yù)MP轉(zhuǎn)錄，從而完成級(jí)聯(lián)反應(yīng)。黑化是另一個(gè)昆蟲(chóng)中特有的免疫反應(yīng)，一系列的CLIP-domain SPs激發(fā)酶原為酚的物質(zhì)，形成黑色素后阻止病原的入侵。

3.2Glossina morsitans中CLIP-domain SPs的鑒定和進(jìn)化分析

目前，通過(guò)Expressed Sequence Tag（EST）、基因組和蛋白組技術(shù)能夠快速地鑒定CLIP-domain SPs的基因。在Glossina morsitans中，通過(guò)生物信息方法找到CLIP-domain SPs的EST后，同已知物種中的CLIP-domain SPs進(jìn)行相似性比對(duì)和進(jìn)化分析，找到了在果蠅中存在并且和免疫相關(guān)的Persephone、SPE、Snake、Spirit基因；認(rèn)為它們可能行使這種分子功能，然后參與到Glossina morsitans的免疫過(guò)程中[14]。

4討論

蛋白酶在很多物種中都普遍存在，起著重要作用。絲氨酸蛋白酶超家族作為蛋白酶，參與到昆蟲(chóng)生理生化中的各種過(guò)程中。隨著轉(zhuǎn)錄組、基因組和蛋白組的快速建立，通過(guò)生物信息的方法使我們能夠快速有效的獲得目標(biāo)基因，并且研究它們的表達(dá)變化。對(duì)于已知的基因和蛋白序列進(jìn)行遺傳分析，能使我們明確分子間的進(jìn)化關(guān)系和進(jìn)化過(guò)程中的機(jī)理。在昆蟲(chóng)中，Tryp_SPC和CLIP-domain SPs是絲氨酸超家族中的兩大類亞家族，它們參與到昆蟲(chóng)的食物消化和免疫反應(yīng)中，發(fā)揮著積極有效的作用。通過(guò)對(duì)它們分子研究和進(jìn)化分析，使得我們能進(jìn)一步明確它們的功能，從而為害蟲(chóng)的防治提供了理論依據(jù)，為以后的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）