摘 要 從生長于沈撫污灌區(qū)的野生東方蓼、狗尾草、稗草、山萵苣等植物組織中分離純化出46株植物內(nèi)生菌，經(jīng)用含Cd2+培養(yǎng)基篩選，得到對重金屬鎘具有較強抗性的細菌菌株EB12-6。觀察其形態(tài)特征，研究對Cd2+去除情況以及溫度、pH、O2、NaCl對菌株生長的影響，結(jié)果表明：EB12-6菌株為好氧革蘭氏陰性菌，有鞭毛；在pH為7.5，37℃溫度，培養(yǎng)時間36 h，初始Cd2+濃度為20 mg/L條件下，對Cd2+去除率可達63.88%。

關鍵詞 鎘抗性；植物內(nèi)生菌；細菌；菌株；Cd2+去除

中圖分類號：S156.99；X53 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.22.029

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重金屬污染是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染，是最嚴重、最難治理的環(huán)境問題之一，重金屬污染的嚴重性和普遍性早已引起了國內(nèi)外的廣泛關注。鎘是生物毒性最強的重金屬，被列為五大毒物[鎘（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、鉻（Cr）、鉛（Pb）]之首[1-5]。極微量的鎘就可對人體造成傷害，它可通過食物鏈在植物體、動物體、人體內(nèi)大量富集，具有穩(wěn)定、積累和不易消除等特點，危害人和動物健康，甚至造成死亡[6-8]。由于鎘等重金屬污染毒理機制和生物效應的復雜性，對重金屬污染問題的研究已成為土壤學、環(huán)境科學、生態(tài)學等的重點、難點和熱點。

植物內(nèi)生菌是指在植物體內(nèi)完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病癥，并與宿主建立互惠共生關系的一類微生物。內(nèi)生菌普遍存在于目前已研究過的各種高等植物中，它們在植物體內(nèi)進行生命活動時，能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，這些物質(zhì)能對宿主植物的產(chǎn)生巨大的影響。有研究表明，內(nèi)生菌能促進宿主生長，提高宿主抗逆性，增強宿主競爭力[9]。近年來，研究植物內(nèi)生菌與植物間的互作，探討植物內(nèi)生菌對于環(huán)境污染的修復作用及機制，利用植物和其內(nèi)生細菌來降解環(huán)境污染物并應用于生產(chǎn)實踐已成為學術界研究的熱點。內(nèi)生菌作為生物防治資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生領域有著巨大的應用潛力[10-11]。

本研究對污灌區(qū)野生植物體內(nèi)的植物內(nèi)生菌進行分離純化，采用Cd2+富集方法從中篩選對鎘有抗性的菌株，研究其形態(tài)、生長特性以及對Cd2+去除情況，以便為進一步探索內(nèi)生菌與宿主植物的協(xié)同作用、提高植物修復效率提供理論支持，為利用植物內(nèi)生菌處理重金屬污染工作奠定基礎[12-15]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試植物

2010年9月于遼寧撫順市李石開發(fā)區(qū)沈撫污灌區(qū)采集野生植物：東方蓼、狗尾草、稗草、山萵苣、北柴胡、大花鬼針草等，取樣后于48 h內(nèi)用其根莖健康組織進行植物內(nèi)生菌的富集和分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離用培養(yǎng)基：固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

篩選用培養(yǎng)基：在配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基的過程中分別加入CdCl2，使培養(yǎng)基中含Cd2+濃度分別為25， 50， 100， 150 mg/L。

1.2方法

1.2.1 內(nèi)生菌菌株的分離、純化

取所采集植株的根、莖分別用流水沖洗干凈，用75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3～4次，0.1%升汞浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次。用無菌解剖剪刀或無菌手術刀將根、莖組織切成5～10 mm大小組織塊，分別貼于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基平板上，同時將最后一遍沖洗的無菌水取適量涂布平板，分別于37℃、28℃環(huán)境下培養(yǎng)數(shù)天，若無菌水涂布的平板無雜菌生長，則將正常處理的平板上長出的菌落按常規(guī)方法純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗鎘內(nèi)生菌菌株的篩選

將已分離純化的活化內(nèi)生菌液按5%（V/V）接種量分別接種于含Cd2+濃度為25， 50， 100， 150 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液或PDA培養(yǎng)液中，37℃或24℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，將振蕩培養(yǎng)后的培養(yǎng)液分別稀釋到10-3， 10-4， 10-5倍涂布在含Cd2+濃度為20 mg/L的相應培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落，如此反復得到抗鎘內(nèi)生菌菌株。將已得到的抗鎘菌株接種于斜面固體培養(yǎng)基上，置4℃冰箱保存。

1.2.3 Cd2+去除率的測定

采用原子吸收分光光度法測定Cd2+濃度。將培養(yǎng)液4000 r/min離心20 min除去菌體，殘留的上清液用于測定Cd2+濃度，以不含菌的含Cd2+培養(yǎng)液為對照[8]。

Cd2+去除率%=[（C0-C）/C0]×100%

其中為C0為Cd2+的初始濃度（mg/L），C為Cd2+的殘留濃度（mg/L）。

1.2.4 抗鎘內(nèi)生菌EB12-6菌株的形態(tài)學觀察

1.2.4.1 菌落形態(tài)

采用稀釋涂布法將所分離得到的抗鎘內(nèi)生菌接種于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1～2 d，觀察其菌落特征。

1.2.4.2 菌體形態(tài)

分別采用單染色法、革蘭氏染色法、鞭毛染色法等對抗鎘內(nèi)生菌進行染色觀察和描述，同時采用顯微鏡直接測定法測定菌體大小。

1.2.5 抗鎘內(nèi)生菌EB12-6菌株生長特性的測定

1.2.5.1生長曲線的測定

將抗鎘內(nèi)生菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，置37℃，120 r/min培養(yǎng)，分別于0， 4， 8， 12， 24， 48， 60， 72， 84， 96 h測定OD600值，以未接菌的培養(yǎng)液作為對照。依據(jù)所測數(shù)據(jù)繪制生長曲線。

1.2.5.2最適培養(yǎng)溫度的測定

將抗鎘內(nèi)生菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，分別置于12℃、25℃、37℃、45℃、50℃恒溫振蕩器，120 r/min，培養(yǎng) 36 h，測定OD600值。

1.2.5.3初始pH值對EB12-6菌株生長的影響

將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液分別調(diào)制pH為4， 5， 5.5， 6， 6.5， 7， 7.5， 8， 8.5， 9， 10，分別接種抗鎘內(nèi)生菌，置于37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，分別測其OD600值。

1.2.5.4不同裝液量對EB12-6菌株生長的影響

將將抗鎘內(nèi)生菌接種于裝液量為50， 75， 100， 150 mL的250 mL三角瓶中，37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，分別測其OD600值。

1.2.5.5NaCl濃度對EB12-6菌株生長的影響

將抗鎘內(nèi)生菌接種于含NaCl濃度為0.5%， 1%， 2%， 3%， 5%， 10%的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，分別測其OD600值。

2結(jié)果與分析

2.1抗鎘內(nèi)生菌株的分離純化及篩選

經(jīng)組織分離法分離純化得到46株植物內(nèi)生菌，其中23株細菌、23株真菌。經(jīng)用含Cd2+培養(yǎng)基篩選，得到6株對重金屬鎘具有抗性的菌株，其中4株真菌（EF12-2、EF12-4、EF12-6、EF12-9），2株細菌（EB12-6、EB12-9）。

2.2Cd2+去除率的測定

采用原子吸收分光光度法測定已篩選得到的6株內(nèi)生菌的Cd2+去除效果見表1。由表1可見，2株內(nèi)生細菌對Cd2+的去除效果較好，去除率均達60%以上，而4株內(nèi)生真菌的Cd2+的去除作用相對較弱。根據(jù)對Cd2+的去除作用效果，最終選取內(nèi)生細菌EB12-6菌株進行深入的實驗研究。

2.3EB12-6菌株形態(tài)特征

EB12-6在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的菌落特征是：菌落呈乳白色規(guī)則圓形，邊緣整齊，表面光滑。EB12-6菌體呈短桿狀，長度為0.9～1.25 μm，寬度為0.65～0.85 μm；無芽孢、莢膜，有鞭毛，革蘭氏染色陰性。

2.4EB12-6菌株生長特性

2.4.1 EB12-6菌株生長曲線

EB12-6菌株生長曲線見圖1。由圖1可以看出，菌株在0～4 h處于延遲期，4～36 h為對數(shù)增長期，36～48 h為穩(wěn)定期，48～96 h為衰亡期。

2.4.2 溫度對EB12-6菌株生長的影響

由表2可見，溫度對EB12-6菌株生長影響顯著，EB0901菌株在12～45℃時均能良好生長，在10～12℃時生長遲緩，當培養(yǎng)溫度超過37℃后，菌株的生長受到明顯的抑制，在50℃以上基本不生長，生長適宜溫度為25～45℃，最適生長溫度為37℃。

2.4.3 初始pH對EB12-6菌株生長的影響

初始pH值對EB12-6菌株生長有明顯影響，當pH值為4時，該菌株基本不生長，在pH5～10時均可生長，其中，pH值為6～8時出現(xiàn)生長高峰，在pH值為7.5時，生長最好。EB12-6菌株可在中性偏堿性條件下生長（見表3）。

2.4.4 不同裝液量對EB12-6菌株生長的影響

不同裝液量對EB12-6菌株生長有一定影響（見表4）。隨著裝液量的增加，菌體的增長呈下降趨勢，即當裝液量增加時，菌體生長所需的氧氣含量減少，而氧氣含量的多少影響菌體的生長，說明EB12-6為好氧菌。

2.4.5 不同NaCl濃度對EB12-6菌株生長的影響

由表5可以看出，不同NaCl濃度對EB12-6菌株的生長有較大影響，在NaCl濃度為0.5%～5%時均可生長，在0.5%～3%時生長良好，當NaCl濃度大于3%時，菌株生長速度下降，當NaCl濃度為10%時，菌體幾乎不生長。由此可見，EB12-6菌株具有一定的耐鹽性。

3結(jié)論與討論

從污灌區(qū)生長的植物體內(nèi)分離純化46株植物內(nèi)生菌，經(jīng)用含Cd2+培養(yǎng)基篩選得到6株抗鎘植物內(nèi)生菌，其中2株內(nèi)生細菌、4株內(nèi)生真菌。6株內(nèi)生菌的Cd2+去除率不同，內(nèi)生細菌的抗鎘能力較強，均達到60%以上。由此可見，在污灌區(qū)生長的植物體內(nèi)存在有多種內(nèi)生菌（細菌和真菌），有的內(nèi)生菌對某些造成污染的因素（如重金屬鎘）具有抗性，有的則沒有，而具有抗性的內(nèi)生菌其抗性強弱也有差別。

鎘抗性細菌菌株EB12-6在pH7.5，37℃，培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)基初始Cd2+濃度為20 mg/L條件下，對Cd2+去除率達63.88%，但作為內(nèi)生菌，當其侵染植物體與植物體共生聯(lián)合作用時，對環(huán)境鎘的去除作用效果和作用機理以及該菌株是否對其他重金屬如鉛、銅、鎳、鋅也具有一定的抗性，還有待深入研究。

生長于沈撫污灌區(qū)的野生植物對石油烴、重金屬等有一定的吸收作用，具有較強的脅迫抗性，而這是否得益于其體內(nèi)存在的抗脅迫內(nèi)生菌，尚難確定。內(nèi)生菌與植物之間的互作影響及機制已成為當今生態(tài)學、微生物學和植物生理學探究的熱點問題[9-12]，深入研究和開發(fā)植物內(nèi)生菌資源，利用內(nèi)生菌與其宿主植物聯(lián)合修復重金屬污染具有重要的理論研究意義和實踐應用價值。

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（責任編輯：丁志祥）