藏金萍 韓志校 姜軍坡

摘要：為提高解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，以濾紙酶活力為指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，建立以濾紙酶活力為響應(yīng)值的二次回歸方程模型，并利用響應(yīng)面法分析得到深層液體發(fā)酵的最優(yōu)條件是：葡萄糖含量為4.4%，豆餅粉含量為0.7%，接種量為 3.0%，裝瓶量為67.6 mL，此時(shí)供試菌株相應(yīng)的濾紙酶活力達(dá)到12.32 U/mL，菌株產(chǎn)纖維素酶活力提高了27.4倍。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面；濾紙酶；纖維素酶；發(fā)酵條件；菌株

中圖分類號(hào)： TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0368-03

收稿日期：2015-02-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家星火計(jì)劃（編號(hào)：2010GA105010）；石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：08150142A）。

作者簡(jiǎn)介：藏金萍（1981—），男，遼寧撫順人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事分子與微生物學(xué)研究。E-mail：jpzang@163.com。

通信作者：姜軍坡，碩士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物方向研究。Tel：（0312）7528273；E-mail：jjp_poe@126.com。纖維素是豐富的可再生資源和碳水化合物，可轉(zhuǎn)化為糖類，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成乙醇、菌體蛋白或氣體燃料。農(nóng)作物秸稈的主要成份是纖維素，而我國(guó)目前農(nóng)作物秸稈的年產(chǎn)量可達(dá)10 t，其中一半以上被焚燒或廢棄[1]。人口增加和耕地面積銳減之間的矛盾，使人畜爭(zhēng)糧問(wèn)題日益突顯。通過(guò)纖維素酶降解、利用纖維素資源已成為目前非常規(guī)資源研究的熱點(diǎn)[2]，提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率，對(duì)解決當(dāng)今世界面臨的環(huán)境污染、飼料資源緊張和能源危機(jī)等具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[3]。

纖維素酶是微生物分解纖維素時(shí)合成的一種胞外酶，其產(chǎn)量直接影響纖維素的利用率。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)一定的外部條件優(yōu)化，可以提高產(chǎn)酶活力[4]。纖維素酶發(fā)酵條件優(yōu)化常采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，但這種方法不能考察各因素之間的交互作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)各因素達(dá)到最優(yōu)[5]。響應(yīng)面分析法通過(guò)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可使用最少的試驗(yàn)次數(shù)盡可能精確地估計(jì)各因素，對(duì)各因素水平及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)和優(yōu)化，快速有效地確定多因子的最佳條件[6-8]，是一個(gè)十分有效的優(yōu)化試驗(yàn)方法。

解淀粉芽孢桿菌Tu-115菌株是一株胞外產(chǎn)纖維素酶，能有效抑制大腸桿菌，本研究組對(duì)其產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件已進(jìn)行一些研究[9-10]，但菌株固體發(fā)酵生產(chǎn)機(jī)械化程度較低，缺乏在線傳感儀器，過(guò)程控制較為困難，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。本試驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)，考察影響Tu-115菌株深層液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的關(guān)鍵因素如葡萄糖含量、豆餅粉含量、接種量、裝瓶量，旨在利用響應(yīng)面法確定該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳工藝參數(shù)，為其大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株Tu-115菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院制藥工程系提供。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑Mandels無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液、DNS試劑，配制方法參考文獻(xiàn)[9]；芽孢桿菌種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液100 mL，自然pH值。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶活性的測(cè)定

1.2.1.1酶活力測(cè)定原理采用3，5-二硝基水楊酸比色法[11]（DNS法）測(cè)定纖維素酶的酶活力。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取無(wú)水葡萄糖分析純100 mg，溶于蒸餾水中，定容至100 mL，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液；取11支試管，分別加入不同體積的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液，用蒸餾水定容至50 mL，將母液稀釋成不同濃度；分別吸取1.0 mL，分別加入3 mL DNS，沸水浴10 min；用流水冷卻至室溫，加入6.0 mL蒸餾水，混勻，測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為x軸，吸光度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.3Tu-115發(fā)酵液纖維素酶比活力測(cè)定取發(fā)酵液 1 mL 加入EP管中，12 000 r/min離心5 min；試管中加入 0.5 mL 上清液，加入1 mL濃度為1 mol/L NaOH溶液，搖勻以終止反應(yīng)；加入75 mg濾紙和1.5 mL濃度為0.05 mol/L、pH值為4.5的乙酸鈉溶液，50 ℃反應(yīng)30 min；加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻，所得溶液作為空白調(diào)零。

在另1支試管中加入75 mg濾紙、1.5 mL濃度為 0.05 mol/L、pH值為4.5的乙酸鈉溶液和0.5 mL粗酶液，50 ℃ 反應(yīng)30 min，加入1 mL濃度為1 mol/L NaOH溶液，搖勻以終止反應(yīng)；加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻，測(cè)定吸光度。每1 min催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.2Tu-115菌株種子液培養(yǎng)將菌種用5 mL無(wú)菌蒸餾水從1支斜面培養(yǎng)基上沖洗下來(lái)，接種于裝有種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，裝瓶量為100 mL；37 ℃ 200 r/min，搖床培養(yǎng)12 h，待用。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶條件采用Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)，對(duì)影響菌株產(chǎn)纖維素酶的4個(gè)因素分別選取不同水平（表1），以進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2結(jié)果與分析

2.1DNS法測(cè)定葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)DNS法測(cè)定葡萄糖吸光度值，得回歸方程為y=1.393 8 x（r2=0.996 6），其線性關(guān)系良好。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2響應(yīng)面發(fā)酵試驗(yàn)與數(shù)據(jù)回歸

采用Box-Benhnken組合設(shè)計(jì)，對(duì)影響菌株Tu-115產(chǎn)纖維素酶的4個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行29組試驗(yàn)，計(jì)算濾紙酶活力及其平均值（表2）。采用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，以濾紙酶活力為響應(yīng)值（Y），葡萄糖含量、豆餅粉含量、接種量、裝瓶量為自變量，建立回歸方程為：Y=-47.096+15.537A+1.526B+1.529C+1.198D+0.258AB+0.297AC-5.208×10-3AD+0.364BC+1.347×10-2BD+0.0680CD-1.826A2-2.877B2-0.787C2-1.025×10-2D2（R2=0.740 2），方程擬合程度良好，試驗(yàn)誤差較小。

2.3回歸方程顯著性檢驗(yàn)

由表3可見，以濾紙酶為指標(biāo)的產(chǎn)纖維素酶深層液體發(fā)表3以濾紙酶為指標(biāo)的產(chǎn)纖維素酶深層液體發(fā)酵條件響應(yīng)面模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

酵條件響應(yīng)面模型P值為0.004 3，小于0.01，說(shuō)明不同條件下差異具有極顯著性，試驗(yàn)方法可行；失擬項(xiàng)不顯著，這表明模型選擇相對(duì)合適；A、B、A2、D2對(duì)濾紙酶活的影響顯著，其他各因素交互作用均不顯著，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；由P值大小可知，各因素對(duì)結(jié)果的影響大小為：豆餅粉含量>葡萄糖含量>接種量>裝瓶量。離散系數(shù)（CV）一般表示試驗(yàn)的精確度，其值越小，試驗(yàn)結(jié)果的可靠性越高，本試驗(yàn)CV值為0.004 3，在可接受范圍內(nèi)，所得二次回歸方程可以很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.4響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸，擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面及其等高線。由圖2至圖7可見，葡萄糖含量與豆餅粉含量相互作用較弱，沿豆餅粉含量方向的等高線密度大于沿葡萄糖含量方向的等高線密度，豆餅粉含量對(duì)酶活力的影響大于葡萄糖含量（圖2）；葡萄糖的含量與接種量相互作用較強(qiáng)，沿葡萄糖含量方向的等高線密度大于沿接種量方向的等高線密度，葡萄糖含量對(duì)酶活力的影響大于接種量（圖3）；葡萄糖的含量與裝瓶量相互作用較強(qiáng)，沿葡萄糖含量方向的等高線密度大于沿裝瓶量方向的等高線密度，葡萄糖含量對(duì)酶活力的影響大于裝瓶量（圖4）；接種量與豆餅粉的含量相互作用較強(qiáng)，沿豆餅粉含量方向的等高線密度大于沿接種量方向等高線的密度，豆餅粉含量對(duì)酶活力的影響大于接種量（圖5）；豆餅粉含量與裝瓶量相互作用較強(qiáng)，沿豆餅粉方向的等高線密度大于沿裝瓶量方向的等高線密度，豆餅粉含量對(duì)酶活力的影響大于裝瓶量（圖6）；接種量與裝瓶量的相互作用較強(qiáng)，沿裝瓶量方向的等高線密度小于沿接種量方向的等高線密度，裝瓶量對(duì)酶活力的影響小于接種量（圖7）。

2.5Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶響應(yīng)面結(jié)果的優(yōu)化分析和條件驗(yàn)證

試驗(yàn)結(jié)果表明，回歸方程對(duì)響應(yīng)面法優(yōu)化Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶深層液體發(fā)酵條件試驗(yàn)結(jié)果擬合良好，可用此回歸方程對(duì)該菌株產(chǎn)纖維素酶深層液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化分析。采用Design Expert 8.0.6軟件獲取濾紙酶活力極大值，方法為：選取Optimization→Numerical→Criteria，選定指標(biāo)“濾紙酶活力”；Goal設(shè)定為maximize→Solution，從Solution尋找最大響應(yīng)值為12.23 U/mL，此時(shí)葡萄糖含量為4.44%、豆餅粉含量為0.67%、接種量為2.95%、裝瓶量為67.61 mL?？紤]試驗(yàn)的實(shí)際情況， 確定最優(yōu)條件為葡萄糖含量為4.4%、豆餅粉含量為0.7%、接種量為3.0%、裝瓶量為67.6 mL，此條件測(cè)定得該菌株相應(yīng)的濾紙酶活力為（12.32±0.41）U/mL（n=6）。優(yōu)化前采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌株對(duì)應(yīng)的平均酶活力為（0.45±0.02）U/mL（n=6），優(yōu)化后菌株產(chǎn)纖維素酶活力提高了27.4倍。

3結(jié)論

本試驗(yàn)采用DNS染色法，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，對(duì)以Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的深層液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到由影響產(chǎn)纖維素酶活力發(fā)酵的各因素變量構(gòu)成的二次方程，該模型回歸顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合良好。在此基礎(chǔ)上，確定Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的深層液體發(fā)酵最優(yōu)工藝條件，為該菌株的大規(guī)模發(fā)酵和應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。采用響應(yīng)面法能很好地預(yù)測(cè)產(chǎn)纖維素酶的深層液體發(fā)酵條件，方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠，具有一定的實(shí)用和推廣價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]潘春梅，王輝，任敏. 纖維素酶液體發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008，31（8）：120-124.

[2]楊麗娜，張建，龔月生. 響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus subtilis NP29產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究[J]. 飼料工業(yè)，2012，33（14）：48-52.

[3]孫君社，李雪，董秀芹. 纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（2）：85-87.

[4]李悅，薛橋麗，李世俊，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵工藝[J]. 食品科學(xué)，2014，35（17）：137-145.

[5]褚以文. 微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其OPTI優(yōu)化軟件[J]. 國(guó)外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，1999，20（2）：58-60，66.

[6]胡麗娟，薛高尚，盧向陽(yáng)，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌25-2產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件[J]. 釀酒科技，2012（4）：21-26.

[7]陳帥，劉琨毅，鄭佳，等. 基于響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒黃水酶促酯化條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（12）：205-209.

[8]王琳，趙荷娟，魏?jiǎn)⑺矗? 雙孢蘑菇子實(shí)體多糖的響應(yīng)面法優(yōu)化提取及其純化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：1139-1146.

[9]姜軍坡，朱寶成，王世英. 以濾紙酶活力為指標(biāo)優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件[J]. 飼料工業(yè)，2014，35（20）：43-47.

[10]尚偉，姜軍坡，王世英，等. 兔源益生菌Tu-115菌株鑒定及其產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè)，2012，33（2）：55-60.

[11]周向軍，高義霞. 3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定薺菜多糖含量的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（35）：17297-17298，17308.魏宇航，唐德善 . 農(nóng)業(yè)水足跡與水資源配置模型[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：375-377.