楊鵬

（山西農(nóng)業(yè)大學信息科學與工程學院，太谷 030801）

細胞質(zhì)雄性不育系轉(zhuǎn)錄組學研究進展

楊鵬

（山西農(nóng)業(yè)大學信息科學與工程學院，太谷 030801）

細胞質(zhì)雄性不育是植物雜種優(yōu)勢利用的基礎，也是研究線粒體基因與核基因之間相互作用的良好材料。采用DNA芯片和RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析能夠在同一個實驗中分析和比較成千上萬個基因，這為在基因組水平上更好地了解植物生長和發(fā)育機制以及遺傳變異提供了可能。在細胞質(zhì)雄性不育機理的研究上，通過轉(zhuǎn)錄組分析將獲得詳細的相關分子分析的信息，了解線粒體與核基因之間的相互調(diào)控作用方式，并有助于雄性敗育機理的解析。

細胞質(zhì)雄性不育；轉(zhuǎn)錄組學；線粒體反向調(diào)控；差異表達基因

細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）是高等植物中不能產(chǎn)生有功能花粉的一種母性遺傳性狀［1］。研究認為，一般情況下CMS背景下的花粉敗育是與線粒體基因組非正常的重組產(chǎn)生的嵌合ORFs相關的［2］。很多與CMS相關的線粒體基因能被一個或多個核恢復基因的產(chǎn)物抑制或削弱［3］。因此，CMS不僅是雜種優(yōu)勢利用的基礎，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要價值，而且研究CMS性狀為研究線粒體基因和核基因之間的相互作用提供了一條有效的途徑。

CMS作為高等植物的一種重要的生物學性狀，要了解其發(fā)生機制，必須對其CMS發(fā)生的分子機理進行深入的研究。目前為止，在各種植物中已經(jīng)確定了超過50種線粒體CMS相關基因［4-7］。然而線粒體可讀框?qū)е滦坌圆挥奶禺愖饔脵C理目前尚不清楚，需要更好的證據(jù)來證明線粒體orf針對性表達導致雄性不育。

雄性不育的形成涉及育性相關基因在一定時空上的表達及其參與的復雜生理生化過程。以往對花粉發(fā)育突變體的研究大多著重于突變基因本身的

表達特點、作用方式和在花粉發(fā)育中的功能，很少注意此基因突變所引起的其它基因的表達變化，但如果沒有從線粒體到細胞核的信號轉(zhuǎn)導，線粒體蛋白單獨直接導致雄性不育是不可能的。由于在基因表達中存在線粒體和細胞核之間的相互作用［8，9］，從線粒體到細胞核的信號被稱為線粒體反向調(diào)控（mitochondrial retrograde regulation，MRR）。研究表明，植物基因突變造成的線粒體功能障礙，通過改變核基因的表達導致雄性不育的發(fā)生［10］。近年來，許多研究都集中在線粒體對高等植物核基因表達的調(diào)控作用上［11-14］。將遺傳學和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合起來研究突變體，已成為一種解析真核生物細胞功能分子網(wǎng)絡中的轉(zhuǎn)錄組分的有效方法［15］。

轉(zhuǎn)錄組的研究方法主要有：（1）基于雜交技術(shù)，如CDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于測序技術(shù)，如早先基于 Sanger 測序的 SAGE（serial analysis of gene expression）和大規(guī)模平行測序（massively parallel signature sequencing，MpSS） 技 術(shù)、 全 長cDNA 文庫和 EST 文庫測序；現(xiàn)在對cDNA、EST等的測序工作已升級為第二代測序技術(shù)，即（3）轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（transcriptome sequencing）。新一代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的出現(xiàn)如Illumina Solexa、羅氏454以及ABI的固體平臺通過提供廉價和快速的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)徹底改變了生物學的研究模式［16，17］，提供了一個從眾多的分子標記或差異表達基因中來確定與某一特征相關關鍵基因的機會，可以用來預測單個基因的相互作用，以及闡明更復雜的信號通路。

擬南芥的遺傳分析和轉(zhuǎn)錄組研究為研究花粉發(fā)育和功能開了先河［18，19］。10多年來，雄性不育的研究主要集中在差異表達基因（differentially expressed genes）的研究上［20］。采用DNA芯片和RNA測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析能夠在同一個實驗中分析和比較成千上萬個基因，這為在基因組水平上更好地了解植物生長和發(fā)育機制以及遺傳變異提供了可能［21］。

1 采用微陣列進行CMS轉(zhuǎn)錄組研究

到目前為止，僅在水稻、油菜、大白菜和棉花中嘗試采用微陣列鑒定與CMS相關基因的轉(zhuǎn)錄組分析。有限的關于CMS微陣列研究表明了細胞核和線粒體相互作用在核基因調(diào)控細胞器基因表達中的重要性，同時細胞器如線粒體信號傳遞也調(diào)控核基因的表達，即反向信號［22］。

Carlsson等［11］采用擬南芥花器官特異cDNA微陣列檢測到了大量的存在于蕓薹屬植物（Brassica napus）的CMS系和其正?？捎谋３窒抵械幕ńM織差異表達的核基因。核基因編碼的蛋白質(zhì)導入細胞器、雄蕊，并影響花粉特異表達基因。與保持系相比，CMS系中參與細胞壁重構(gòu)的基因表達被抑制。研究結(jié)果表明，細胞質(zhì)雄性不育是線粒體通過調(diào)節(jié)細胞核基因的表達及調(diào)控花的發(fā)育所致。

Fujii等［22］進行了CW-CMS 系和具有正常水稻（Oryza sativa）細胞質(zhì)的保持系rf17rf17成熟花藥中的比較核基因表達研究。在CMS系多于3個發(fā)育階段中，觀察到上調(diào)表達的8個基因和下調(diào)表達的82個基因。CMS系中一些極端上調(diào)表達基因包括編碼交替氧化酶（AOX）、蛋白酶家族、myb家族轉(zhuǎn)錄因子和mRNA結(jié)合蛋白。下調(diào)基因包括過氧化物酶、果膠酶家族蛋白、葉綠素b結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白和MATE外流性運轉(zhuǎn)家族蛋白。植物CMS的發(fā)生是由于線粒體基因功能的喪失，這些結(jié)果顯示線粒體反向調(diào)控在核基因特異表達中起重要作用，而且這種調(diào)控作用導致的核基因表達改變對CMS植株有特殊的效應。在CW-CMS水稻中下調(diào)表達的基因DCW11——編碼線粒體蛋白磷酸酶2c，被證明是與CMS相關的［23］。

Dong等［24］采用蕪菁300-K低聚探針（br300 k）芯片對Ogura-CMS白菜及其保持系進行花蕾轉(zhuǎn)錄組分析，以研究蕪菁亞種-大白菜細胞質(zhì)雄性不育（CMS）的調(diào)節(jié)機制。通過微陣列鑒定了4 646個在中國大白菜 Ogura-CMS系和其保持系B. rapa ssp.的花蕾間差異表達基因。Ogura-CMS系有與脅迫和氧化還原相關的特異表達基因，但是缺乏與花粉外壁和萌發(fā)相關的表達基因。許多與生長素相應、ATP合成、花粉發(fā)育和逆境應激反應相關的核基因在Ogura-CMS植株中延遲表達，延遲表達可能減少花粉的產(chǎn)生和/或?qū)е虏挥@意味著線粒體反向信號抑制核基因表達。

在棉花CMS的轉(zhuǎn)錄組研究中，Suzuki等［25］采

用包括24 132個轉(zhuǎn)錄本的棉花基因組微陣列，研究具有D8細胞質(zhì)的棉花CMS及其恢復系處于減數(shù)分裂時期的花蕾之間的差異表達基因（DE）。在CMS-D8中共檢測到458個DE基因，其中包括上調(diào)127個基因和331個下調(diào)基因。最常見的基因是參與細胞壁擴張的編碼假定蛋白，如果膠、果膠酸裂解酶、果膠甲酯酶、乙二醛氧化酶、多聚半乳糖醛酸酶、吲哚乙酸合成酶和木葡糖內(nèi)切酶。細胞骨架范疇的基因包括肌動蛋白在不育系和可育系之間高度差異表達，肌動蛋白在細胞壁擴張、細胞延伸和細胞分裂中期重要作用。研究結(jié)果認為，細胞核基因編碼的恢復基因不僅恢復功能性花粉的形成，而且也影響著眾多核基因編碼的基因；通過下一步的研究，從大量的差異表達基因中將篩選出與CMS 形成相關的基因。

2 采用RNA測序進行CMS轉(zhuǎn)錄組研究

盡管基于微陣列的轉(zhuǎn)錄譜研究可以詳細檢測不同樣品中的基因表達，但這種方法具有局限性，因為基因通過非特異性探針設置表明，不能可靠檢測到低水平的表達。高通量的轉(zhuǎn)錄組測序分析是轉(zhuǎn)錄組分析的一個強有力工具。

近年來，RNA測序已經(jīng)廣泛應用于多種植物的轉(zhuǎn)錄組研究［26-32］，并已應用到辣椒、油菜、棉花、柑橘和紅麻等植物的CMS不育機理的相關研究中。

Liu等［33］對辣椒細胞質(zhì)雄性不育系 121A及其近等基因系121C的轉(zhuǎn)錄組進行了分析，并分析了基因（unigene）表達的不同豐度?？偣?5.3 GB的數(shù)據(jù)組裝成85 144個基因，分別從121A和121C組裝了71 576和75 920個基因，發(fā)現(xiàn)4 326和7 061個基因分別在121A和121C中高豐度表達。研究認為許多差異表達基因是育花粉形成或花粉敗育的候選基因，為研究線粒體與細胞核相互作用對育性的影響和恢復以及進一步研究提供了線索。

Yan等［34］利用Illumina/Solexa測序平臺，對油菜不育株和可育株小花蕾進行全基因組高通量轉(zhuǎn)錄組測序。從兩個文庫中分別得到242 163（不育）和253 507（可育）個差異標簽。分別以白菜和甘藍CATG + 17核苷酸序列的基因組與轉(zhuǎn)錄組為參考序列，對所有的差異序列標簽進行注釋。在顯著差異表達水平上檢測到3 231個的白菜基因和3 371個甘藍基因差異表達。研究結(jié)果認為：一些基因在不育系和可育系間差異表達，其中的一些基因可能成為今后研究CMS、育性恢復和農(nóng)藝性狀改良的候選基因。

雄性不育和無核性狀是柑橘品種改良理想性狀。Zheng等［35］通過原生質(zhì)體融合培育了一個胞質(zhì)雜種柚，是一個雄性正?？捎值淖兎N。為了了解其發(fā)生的分子機制，采用RNA序列分析，比較了胞質(zhì)雜種和正常可育柚花蕾中核基因表達譜。通過基因表達譜捕獲了大量的在花瓣原基和雄蕊原基區(qū)分的階段兩系間差異表達基因（DEGs）。CMS相關基因的鑒定為研究細胞核和線粒體之間的相互作用提供了新的認知。

Chen等［36］采用Solexa測序技術(shù)，對紅麻細胞質(zhì)雄性不育系及其保持系進行了比較轉(zhuǎn)錄組分析，獲得4 584個在兩系間至少2倍差異表達的基因。其中在不育系中有838個基因的表達量至少高出5倍于其保持系中的表達量，528個基因則在不育系中顯著下調(diào)表達。研究認為，該研究為了解紅麻花藥發(fā)育及CMS產(chǎn)生機理奠定了基礎。

An等［37］為了研究pol-CMS的雄性不育轉(zhuǎn)換機制，構(gòu)建了pol-CMS的近等基因系。采用RNA測序技術(shù)比較了不育和可育花蕾的基因組表達譜，結(jié)果表明有1 148個基因在不育系與可育系花蕾中顯著差異表達，這些差異表達基因主要分布在代謝和蛋白質(zhì)合成途徑中。此外，控制花藥發(fā)育的一些基因在不育花蕾顯著下調(diào)。研究結(jié)果認為，由orf224/ atp6引起的能量缺乏導致一系列調(diào)控花粉發(fā)育的基因被抑制，這種抑制作用是通過線粒體和核基因之間的相互作用實現(xiàn)的。從而導致造孢細胞分化的失敗和pol-CMS的產(chǎn)生。

王嬌［38］以棉花細胞質(zhì)雄性不育系中棉所12A（細胞質(zhì)來自104-7A）和保持系中棉所12為研究材料，采用Illumina新一代高通量測序技術(shù)對花藥轉(zhuǎn)錄組表達譜進行比較分析，并采用代謝物衍生化程序結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）兩種分析技術(shù)對不育系和保持系花藥差異積累的代謝物進行分離和鑒定。通過對轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)進行綜合分析，推測苯丙素、黃

酮類物質(zhì)合成受阻、代謝加快導致體內(nèi)這類物質(zhì)積累減少，這可能是導致104-7A棉花細胞質(zhì)雄性不育形成的原因之一。

我們的研究［39］以棉花晉A細胞質(zhì)雄性不育系及其同核異質(zhì)保持系JB為研究材料，分析了兩個材料在造孢細胞（sporogenous cells stage，SS）和小孢子母細胞（microsporocyte stage，MS）時期花蕾的差異表達基因。結(jié)果顯示：在花藥發(fā)育的兩個階段，分別有5 457（SS）、3 178（MS）和3 608（SS）、3 999（MS）個基因分別在JA和JB中差異表達。對差異表達基因進行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)JA不育系與保持系相比，在JA花藥發(fā)育的造孢細胞時期和小孢子母細胞時期的花蕾中氧化還原酶和雙加氧酶活性下降，而與光合作用相關基因則更多地表現(xiàn)為上調(diào)表達，并且發(fā)現(xiàn)JA細胞質(zhì)雄性不育與能量代謝異常相關。這些差異表達基因為鑒定棉花晉A細胞質(zhì)雄性不育相關基因提供了保障。通過對RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序資料的進一步分析，將獲得細胞質(zhì)反向調(diào)控細胞核基因的表達模式，為闡明雄性不育的分子機制奠定基礎。

3 線粒體對細胞核基因的反向調(diào)控研究

線粒體和質(zhì)體的反向信號影響細胞核基因的表達，從而產(chǎn)生與發(fā)育和生理狀態(tài)相關的協(xié)調(diào)的細胞器組分。盡管線粒體的反向調(diào)控在酵母中已經(jīng)得到比較清楚的研究，但對植物中的 MRR 的過程及機制仍不清楚［40］。由線粒體基因突變導致的細胞質(zhì)雄性不育是線粒體反向調(diào)控典型例子，也是研究 MRR 的良好材料。

玉米 CMS-T 不育性是由于 mtDNA 重排造成的，mtDNA 重排產(chǎn)生了T-urf13，并編碼一種特異的蛋白質(zhì) URF13，而 URF13 是 T 毒素的受體［41］。后來的研究表明 T 毒素和 URF13 之間相互作用，導致線粒體內(nèi)膜的通透性增加和細胞死亡。用一種模仿的 T毒素處理 CMS-T 不育系，誘導了核基因編碼的熱激蛋白和醇脫氫酶基因的表達。線粒體 ATP 合酶的亞基 9 的煙草突變體，表現(xiàn)為雄性不育［42］，其表現(xiàn)為形態(tài)改變和呼吸降低。在此突變體中由核基因編碼的幾個復合體Ⅰ亞基上調(diào)表達。這可能是由于線粒體功能紊亂引起的 MRR。CMSⅡ是煙草的一種線粒體突變體，該突變體缺乏功能性復合物Ⅰ［43］。在該突變體中核基因的表達發(fā)生改變，導致細胞內(nèi)交替氧化酶、抗壞血酸氧化酶和超氧歧化酶基因上調(diào)表達，NAD（P）H脫氫酶活性升高，突變導致細胞氧化還原狀態(tài)的調(diào)整［43，44］。這種突變體嚴重抑制了表型生長，并改變了碳和氮的代謝［43，45］。基于線粒體電子傳遞鏈功能的改變，CMSⅡ突變體植株獲得了一個全新的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這種內(nèi)穩(wěn)態(tài)可能是線粒體向細胞核信號傳遞的改變造成的。

參與花/小孢子形成、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)運輸被認為是 MRR 潛在的目標［11，22，45］。Xu等［46］的研究認為，TaFAd 基因可能是小麥 T- CMS系 MRR 的目標，只是其究竟是 MRR 的主要目標，還是級聯(lián)信號的一個下游組分還不清楚。研究認為，mtROS 可能作為觸發(fā)信號傳導分子［47，48］。同哺乳動物細胞一樣，來源于線粒體的Ca2+［49］、線粒體的氧化還原狀態(tài)和代謝產(chǎn)物的變化可能也是MRR的信號［50］，反向調(diào)控作用主要通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控實現(xiàn)［51］。目前，雖然闡明了線粒體功能紊亂對核基因表達的影響［52］，但是對植物的基本調(diào)節(jié)機制的認識仍然有限。

通過對 CMS 及其正?？捎颠M行轉(zhuǎn)錄組學研究，將獲得一系列在兩系間差異表達的基因，從而可以深入了解細胞質(zhì)雄性不育基因的反向調(diào)控作用，揭示植物細胞質(zhì)雄性不育形成的分子機制。

4 轉(zhuǎn)錄組分析應用展望

轉(zhuǎn)錄組測序主要通過高通量測序研究特定組織或細胞在某個時期轉(zhuǎn)錄出來的mRNA。與基因芯片技術(shù)相比，高通量RNA測序即 RNA-seq 無需設計探針，能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測和量化轉(zhuǎn)錄片段，并能應用于基因組圖譜尚未完成的物種［53］。同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準確地識別可變剪切位點及cSNP、UTR區(qū)域；不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題。

轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎和出發(fā)點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所

有轉(zhuǎn)錄本序列信息，包括基因表達、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)氨基酸含量的信息［54］。因此，轉(zhuǎn)錄組分析是解讀基因組的功能要素、揭示細胞和組織的分子成分的重要手段。在細胞質(zhì)雄性不育機理的研究上，通過轉(zhuǎn)錄組分析將獲得詳細的相關分子分析，了解線粒體與核基因之間的相互調(diào)控作用方式，并有助于雄性敗育機理的解析。

由于花粉的發(fā)育是由正義和反義轉(zhuǎn)錄本的表達以及小分子RNA調(diào)節(jié)的一個復雜的過程［55］?；虻霓D(zhuǎn)錄豐度與基因表達產(chǎn)物的活性沒有必然的聯(lián)系，僅用基因表達量的變化來反映花粉發(fā)育的生理及分子機制顯然不夠準確。蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術(shù)作為對基因活性認識的下游技術(shù)，為更加準確地理解分析花粉發(fā)育過程提供了研究手段。再則，認識不育基因調(diào)控花粉敗育過程，需對花藥細胞結(jié)構(gòu)和功能以及花粉細胞中重要的細胞生物學形態(tài)進行分析。因此，在組學分析的基礎上進行分子和遺傳研究，以期更好地解析植物雄性不育的機理。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Transcriptomics of Plant Cytoplasmic Male Sterility Lines

YANG Peng
（College of Information Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

Cytoplasmic male sterility（CMS）is the basis of utilizing the heterosis of plants，and also favorable material for studying the interaction between mitochondrial genes and nuclear genes. Transcriptomics analysis using DNA microarray and RNA-Seq technology enabled the analysis and comparison of thousands of genes in one experiment. This allows it feasible to better understand fundamental aspects of growth and development，as well as genetic variation in plants on a genomic scale. Based on the mechanism of CMS lines，transcriptomics study may acquire the detailed relevant molecular analysis，understand the interaction mode between mitochondrial and nuclear genes，and be conducive to dissect the male sterility.

cytoplasmic male sterility；transcriptomics；mitochondrial retrograde regulation；differentially expressed gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.001

2016-03-30

山西省科技攻關項目（20140311004-3）

楊鵬，男，博士，研究方向：植物分子生物學；E-mail：yangp@sxau.edu.cn