馬 丹 孔 寧
(1. 北京市和平里醫(yī)院,北京 100013;
2. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣東 廣州 511400)
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注射用血栓通凍干粉對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
馬丹1孔寧2
(1. 北京市和平里醫(yī)院,北京100013;
2. 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣東廣州511400)
摘要:目的觀察注射用血栓通凍干粉是否對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。方法采用過氧化氫制備氧化應(yīng)激損傷模型。分為4個(gè)組,分別為空白對照組、0.5 mg血栓通觀察組,2 mg血栓通觀察組,10 mg血栓通觀察組,利用上述濃度培育RGC-5細(xì)胞24 h后利用400 μm濃度的過氧化氫制備氧化應(yīng)激模型。隨后MTT法觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果經(jīng)過不同濃度注射用血栓通培育后的細(xì)胞,凋亡率明顯下降,各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論注射用血栓通對氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的RGC-5細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。
關(guān)鍵詞:血栓通;RGC-5細(xì)胞;氧化應(yīng)激;凋亡
視神經(jīng)主要是從視網(wǎng)膜各個(gè)方向延伸到視乳頭的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突纖而形成,視神經(jīng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞向視覺中樞傳遞視覺信號(hào),因此神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡是青光眼等眼科疾病的重要病理特征之一。目前研究青光眼等視神經(jīng)損害疾病的發(fā)病機(jī)制主要圍繞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)進(jìn)行[1-2]。注射用血栓通是由三七干燥根提取而成的水溶性純中藥制劑。而三七已有較多研究證實(shí)有抗細(xì)胞凋亡的作用,本研究觀察注射用血栓通是否對RGC-5細(xì)胞有凋亡保護(hù)作用。
1材料和方法
1.1細(xì)胞和藥物
本實(shí)驗(yàn)所用的RGC-5細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,由廣州三騏生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室獲得并保存。注射用血栓通注射液由廣西梧州制藥股份有限公司生產(chǎn)。
1.2RGC-5細(xì)胞凋亡模型的制作
利用過氧化氫制備氧化應(yīng)激損傷模型,將RGC-5細(xì)胞以1×105/cm2濃度接種在24孔板中。加入不同濃度:0、400、1 000 μm過氧化氫,培養(yǎng)24 h,制備氧化應(yīng)激損傷模型培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞, MTT法檢測RGC-5細(xì)胞凋亡情況。
1.3分組和處理
分為4組,分別為空白對照組,0.5、2、10 mg血栓通觀察組。觀察組分別加入上述濃度的注射用血栓通凍干粉,共同培育24 h。因400/1 000 μm均能造成氧化應(yīng)激損傷,我們選用400 μm濃度的過氧化氫并利用上述方法制備氧化應(yīng)激模型。采用MTT法觀察細(xì)胞凋亡情況,每組6個(gè)孔,同時(shí)每個(gè)孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔。
1.4MTT法[3-4]
每間隔24 h向待測孔中加入20 μL無菌MTT(5 mg/mL),細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,徹底去除上清,加入DMSO 150 μL/孔,搖床振蕩10 min,至紫色結(jié)晶充分溶解后,置酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定其吸光度(A)值,按公式計(jì)算生長抑制率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1凋亡模型的制備
不同濃度的過氧化氫(0、400、1 000 μm)作用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,結(jié)果可見,過氧化氫所造成的氧化應(yīng)激損傷,使RGC-5細(xì)胞的凋亡率顯著增加,對空白對照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明利用氧化應(yīng)激制作RGC-5細(xì)胞凋亡模型有效。
2.2注射用血栓通對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
經(jīng)過不同濃度注射用血栓通培育后的細(xì)胞,經(jīng)氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的凋亡率明顯下降,見圖1。各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明隨著注射用血栓通藥物濃度的增加,抗凋亡作用也更加明顯。
圖1 不同干預(yù)下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡率情況(P<0.05)
3討論
注射用血栓通凍干粉的主要有效成分為三七總皂苷,是一種作用較強(qiáng)的內(nèi)皮素拮抗劑,具有抑制花生四烯酸(AA)、ADP 以及血小板活化因子的作用,同時(shí)可阻礙凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用,具有較為強(qiáng)大的纖維溶解作用。已有較多的研究證實(shí),三七有明顯的抗凋亡作用[5],本研究利用注射用血栓通凍干粉保護(hù)氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,此前未見報(bào)道。
在我們的研究中,通過不同濃度的注射用血栓通培育后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,凋亡率明顯下降,且各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明隨著血栓通濃度的增加,抗凋亡作用也更加明顯。之前有研究利用復(fù)方血栓通膠囊提高大鼠視網(wǎng)膜抗氧化、抗缺血的能力,其結(jié)果與本研究相符[6]。但復(fù)方血栓通膠囊成分較為復(fù)雜,有丹參、黃芪、玄參和三七等。其中三七總皂苷可以通過抑制脂質(zhì)過氧化,提高組織的SOD活性,清除氧自由基,故可以對抗氧化應(yīng)激損傷所致的細(xì)胞凋亡。但同時(shí)這也是本實(shí)驗(yàn)的局限性,注射用血栓通是否對其他類型的細(xì)胞凋亡有作用,也是我們下一步的研究目標(biāo)。
本研究通過氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型,證實(shí)了注射用血栓通對凋亡的保護(hù)作用。但本文有一定的局限性,如仍需進(jìn)一步確定最佳濃度、使用其他凋亡模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)等。
參考文獻(xiàn):
[1]JIA W C, LIU G, ZHANG C D, et al. Formononetin attenuates hydrogen peroxide (H2O2)-induced apoptosis and NF-κB activation inRGC-5 cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014,18(15):2191-2197.
[2]BENNET D, KIM S. Effects of agmatine and resveratrol on RGC-5 cell behavior under light stimulation[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2014,38(1):84-97.
[3]GOMATHI R, RAMU A, MURUGAN A. Evaluation of DNA binding, cleavage, and cytotoxic activity of Cu(II), Co(II), and Ni(II) schiff base complexes of 1-Phenylindoline-2,3-dione with isonicotinohydrazide[M]. Bioinorg Chem Appl, 2014,2014(4):29-46.
[4]BAI J, MA M, CAI M, et al. Inhibition enhancer of zeste homologue 2 promotes senescence and apoptosis induced by doxorubicin in p53 mutant gastric cancer cells[J]. Cell Prolif, 2014, 47(3):211-218.
[5]趙菁,耿文靜,翟博智.血栓通注射液治療急性腦梗死氯吡格雷抵抗的臨床觀察[J].中草藥,2015,46(14):2122-2126.
[6]周琳,于強(qiáng),陳瀟,等.復(fù)方血栓通膠囊對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜抗缺氧及抗氧化能力的影響[J].中華眼視光學(xué)與視覺科學(xué)雜志,2012,14(1):41-46.
Protective Effect of Xueshuantong Lyophilized Powder for Injection on RGC-5 Cell Apoptosis Caused by Oxidative Stress
MA Dan1, KONG Ning2
(1. Beijing Hepingli Hospital, Beijing 100013, China;2. Guangzhou Panyu District Central Hospital, Guangdong Guangzhou 511400, China)
Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of Xueshuantong Lyophilized powder for injection on RGC-5 cell apoptosis caused by oxidative stress.MethodsPrepared oxidative stress model using hydrogen peroxide. They were divided into four groups, namely the control group, 0.5 mg Xueshuantong observation group, 2 mg Xueshuantong observation group, 10 mg Xueshuantong observation group, after the cultivated the above-mentioned concentration RGC-5 cells for 24 hours, prepared oxidative stress model with 400 μm concentrations of hydrogen peroxide. Then cell apoptosis was observed by MTT assay.ResultsAfter nurtured by different concentrations of Xueshuantong, the cell apoptotic rate decreased significantly difference between the groups (P<0.05).ConclusionXueshuantong Lyophilized powder for injection has a protective effect on RGC-5 cell apoptosis caused by oxidative stress.
Key words:Xueshuantong; RGC-5 cell; oxidative stress; apoptosis
中圖分類號(hào):R 97
文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
作者簡介:馬丹(1981—),女,藥劑師。E-mail:153949309@qq.com
收稿日期:2015 - 09 - 28
文章編號(hào):1006-446X(2016)02-0043-03