甘新宇,楊　洋,趙景嵐,于麗君

(成都軍區(qū)總醫(yī)院輸血科,四川成都 610083)

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·臨床研究·

酶標(biāo)儀與血小板聚集儀測(cè)定血小板抗低滲休克反應(yīng)的比較分析

甘新宇,楊洋,趙景嵐,于麗君

(成都軍區(qū)總醫(yī)院輸血科,四川成都 610083)

摘要:目的通過(guò)與血小板聚集儀法進(jìn)行比較，建立用酶標(biāo)儀測(cè)定血小板低滲休克反應(yīng)(HSR)的方法。方法分別用酶標(biāo)儀和血小板聚集儀對(duì)含不同比例新鮮血小板的富血小板血漿進(jìn)行HSR檢測(cè)，并對(duì)這兩種方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性進(jìn)行比較分析。結(jié)果酶標(biāo)儀法和血小板聚集儀法測(cè)得HSR分別為(65±24)%和(69±20)%，靈敏度均為20%；采用酶標(biāo)儀法和血小板聚集儀法對(duì)分別含75%、50%、25%球形血小板樣品重復(fù)測(cè)定10次，變異系數(shù)(CV)分別為10.3%、5.2%、3.5%和11.0%、6.2%、4.1%；HSR測(cè)定值準(zhǔn)確度與球形血小板百分比相關(guān),其相關(guān)系數(shù)r分別為0.959 8和0.968 4。結(jié)論酶標(biāo)儀法與血小板聚集儀法對(duì)HSR的測(cè)定無(wú)明顯差異，酶標(biāo)儀可用于HSR的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。

關(guān)鍵詞:血小板低滲休克反應(yīng)；酶標(biāo)儀；血小板聚集儀

血小板低滲休克反應(yīng)(HSR)是指血小板(PLT)在滲透壓低的環(huán)境中會(huì)發(fā)生腫脹變形，一定時(shí)間后又可恢復(fù)其原有形狀，這種變形后又恢復(fù)的能力是反映PLT功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它與PLT的回收率和存活時(shí)間呈正相關(guān)[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)HSR檢測(cè)方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，常用方法包括分光光度計(jì)檢測(cè)法和血小板聚集儀檢測(cè)法[2-3]。本研究利用酶標(biāo)儀對(duì)HSR進(jìn)行檢測(cè)，并與血小板聚集儀檢測(cè)法進(jìn)行靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性等方面的對(duì)比研究，分析酶標(biāo)儀法檢測(cè)HSR的效能?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1樣品制備[4]采用血小板單采儀采集1個(gè)治療量的PLT，取10 mL乏血小板血漿(PPP)，加入單采PLT調(diào)節(jié)PLT濃度至(250～300)×109/L，即富血小板血漿(PRP),將其分為兩份：(1)1份PLT懸液放入專(zhuān)用PLT保存箱中靜置25 h，再振蕩1 h，即為100%的正常PLT；(2)另1份加入2 g/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)后，放入2～4 ℃冰箱儲(chǔ)存24 h，取出放入PLT專(zhuān)用保存箱靜置1 h，再振蕩1 h，即為100%的球形PLT。兩份均用羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.0后待用。

1.2主要儀器Thermo MK3型酶標(biāo)儀(天津開(kāi)元醫(yī)療有限公司)，500CA型血小板聚集分析儀(美國(guó)Chrono-log公司)，ABX60型血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(日本Sysmex公司)。

1.3方法

1.3.1血小板聚集儀法測(cè)定HSR[4]將血小板聚集儀攪拌速度旋鈕調(diào)至刻度10并開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min，然后將PPP、PRP、磷酸鹽緩沖液(PBS)和蒸餾水4種液體放入預(yù)熱槽中預(yù)熱10 min。吸取500 μL PRP和PPP至兩個(gè)測(cè)試杯中，攪拌加有PPP的測(cè)試杯后放置到測(cè)試位,調(diào)節(jié)基線至0%～100%，待基線穩(wěn)定后吸取250 μL PBS加入到PPP中，立即運(yùn)行30 s，記錄PBS的吸光度(A)值(以X表示)；吸取250 μL蒸餾水加入PRP中行相同測(cè)試，記錄A值，待A值達(dá)到平衡后終止測(cè)定，記錄樣品最大A值(以Y表示)和最小A值(以Z表示)。計(jì)算HSR=[(Y-Z)/(Y-X)]×100%。

1.3.2酶標(biāo)儀測(cè)定HSR[5]分別取樣品3份，同時(shí)測(cè)定HSR并取測(cè)定結(jié)果的平均值。(1)測(cè)定最小吸光度(A0)和恢復(fù)15 min后吸光度(A15)：在96孔酶標(biāo)板微孔中加入200 μL蒸餾水，再加入樣品100 μL，蒸餾水調(diào)零，以630 nm波長(zhǎng)作為主波長(zhǎng)，450 nm波長(zhǎng)為第2波長(zhǎng)，用MK3型酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的A0，并于15 min后振蕩15 s再次測(cè)定該樣品的A15。(2)測(cè)定最大吸光度(Amax)：在96孔酶標(biāo)板微孔中加入200 μL PPP，再加入樣品100 μL，PPP調(diào)零，用MK3型酶標(biāo)儀以相同波長(zhǎng)測(cè)定樣品的Amax值。(3)HSR的計(jì)算：HSR=(A15-A0)/(Amax-A0)×100%。

1.3.5準(zhǔn)確性試驗(yàn)[4]按1.3.3同樣方法配制0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT懸液,同樣用酶標(biāo)儀和聚集儀分別檢測(cè)HSR，比較球形PLT水平及其與HSR測(cè)定值的相關(guān)性，以及兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1兩種方法HSR檢測(cè)結(jié)果比較酶標(biāo)儀法測(cè)得HSR為(65±24)%，血小板聚集儀法測(cè)得HSR為(69±20)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.7，P=0.25)。

表1　　兩種HSR檢測(cè)方法的重復(fù)性比較(n=10，%)

2.3兩種方法檢測(cè)HSR的靈敏度比較應(yīng)用兩種方法分別檢測(cè)0%、10%、20%、30%球形PLT懸液,重復(fù)10次檢測(cè)。分別與球形PLT百分比為0%的溶液比較，酶標(biāo)法在球形PLT百分比為20%、30%時(shí)測(cè)得的HSR降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.228、3.169，P<0.05)；血小板聚集儀法在球形PLT百分比為20%、30%時(shí)測(cè)得的HSR也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.764、3.581，P<0.05)。當(dāng)球形PLT增加到20%時(shí)，兩種方法測(cè)得的HSR均開(kāi)始明顯降低,故兩種方法的檢測(cè)靈敏度均為20%。見(jiàn)表2。

表2　　兩種HSR檢測(cè)方法的靈敏度

*：P<0.05，與同種方法球形PLT百分比為0%的懸液比較。

2.4兩種方法檢測(cè)HSR的準(zhǔn)確性及其與PLT水平的相關(guān)性用兩種方法分別對(duì)0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT懸液進(jìn)行HSR檢測(cè)，測(cè)得HSR與球形PLT水平呈明顯正相關(guān)(酶標(biāo)儀法：r= 0.959 8；血小板聚集儀法：r= 0.968 4)。兩種方法測(cè)得25%、50%、75%、100%球形PLT懸液的HSR比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為1.735、1.799、1.703、1.621，P<0.05)，且兩種方法測(cè)得HSR也呈正相關(guān)(r=0.987 5)。見(jiàn)表3。

表3　　兩種HSR檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性

*：P<0.05，與相同球形PLT百分比懸液血小板聚集儀法測(cè)得HSR比較。

3討論

血小板聚集儀檢測(cè)原理有比濁法和電阻法兩種，電阻法適用于全血和血漿檢測(cè)，而比濁法僅適用于血漿檢測(cè)。比濁法實(shí)際就是A值檢測(cè)法，酶標(biāo)儀的檢測(cè)原理也是A值檢測(cè)。在檢測(cè)血漿中PLT的聚集時(shí)，如果能用方便快捷的酶標(biāo)儀代替血小板聚集儀，將會(huì)極大地方便檢驗(yàn)人員。

HSR反映了PLT在低滲環(huán)境中因水進(jìn)入發(fā)生變形后又恢復(fù)其原有正常形態(tài)的能力,在PLT懸液中加入水，懸液即處于低滲狀態(tài)，水滲入PLT,PLT的體積隨即發(fā)生腫脹，光透射增強(qiáng)；如果PLT功能正常，就能逐出細(xì)胞內(nèi)的水份，其體積又能恢復(fù)到正常狀態(tài)，于是光的折射率增強(qiáng)，A值降低。PLT這一體積膨脹又恢復(fù)的變化是由細(xì)胞內(nèi)一系列的復(fù)雜活動(dòng)和細(xì)胞膜離子通道變化及外部刺激所引起。與其他動(dòng)物細(xì)胞一樣，在低滲環(huán)境中，PLT通過(guò)產(chǎn)生一系列反應(yīng)使自身體積腫脹后再恢復(fù)正常，這主要是通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)各種離子的濃度來(lái)維持PLT的體積，通常這種反應(yīng)通過(guò)腺苷三磷酸(ATP)來(lái)完成。即在低滲溶液中細(xì)胞通過(guò)滲透吸水作用使水進(jìn)入，細(xì)胞發(fā)生腫脹，此時(shí)細(xì)胞鈣離子(Ca2+)濃度很快下降，Ca2+濃度下降導(dǎo)致細(xì)胞ATP的釋放，ATP與G-蛋白-磷脂酶C相連接，而后G-蛋白腺苷酸脫氨酶與Ca2+受體連接，導(dǎo)致細(xì)胞膜上鉀離子(K+)、氯離子(Cl-)通道開(kāi)啟，K+、Cl-同向轉(zhuǎn)移，K+、氫離子(H+)泵關(guān)閉。這一系列信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致K+、Cl-和水又從細(xì)胞內(nèi)移出，于是細(xì)胞的體積又恢復(fù)正常[5-6]。檢測(cè)HSR就是通過(guò)檢測(cè)PLT體積膨脹時(shí)光透射變強(qiáng)，而PLT體積恢復(fù)時(shí)光透射又變?nèi)?，?lái)評(píng)價(jià)PLT的體外功能，以細(xì)胞反應(yīng)恢復(fù)率表示。PLT在低滲環(huán)境中體積膨脹到最大時(shí)所需時(shí)間約為18 s。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定HSR時(shí)，加入PRP后混勻8 s，再放入酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度監(jiān)測(cè)，這段時(shí)間大約需要10 s；PLT體積從最大恢復(fù)到正常所需時(shí)間約為15 min，故檢測(cè)時(shí)間設(shè)定在15 min。值得注意的是，環(huán)境溫度對(duì)HSR的測(cè)定有較大影響，22 ℃保存的PLT懸液在測(cè)定前需預(yù)溫至37 ℃后再行測(cè)定。

本研究結(jié)果顯示，酶標(biāo)儀和血小板聚集儀兩種方法測(cè)定HSR無(wú)明顯差異，與文獻(xiàn)[6-10]報(bào)道的40%～80%結(jié)果比較吻合，說(shuō)明酶標(biāo)儀是可以用于測(cè)定HSR的。酶標(biāo)儀是實(shí)驗(yàn)室常用儀器，采用酶標(biāo)儀測(cè)定PLT的HSR，其方法簡(jiǎn)單，所需樣品少，重復(fù)性完全能達(dá)到要求，結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)迅速，可同時(shí)測(cè)定多份樣品。對(duì)于沒(méi)有血小板聚集儀的實(shí)驗(yàn)室，可以選擇用酶標(biāo)儀進(jìn)行HSR檢測(cè)。

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(收稿日期：2015-10-06)·臨床研究·

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.041

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0670-03