張蕾++蔣繼志++于永昂

摘要：TD-12菌株是前期分離篩選得到的在防治馬鈴薯晚疫病中很有潛力的內(nèi)生細菌。為加快對該菌株的深入研究和利用，本試驗利用濾紙片法對其部分發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，結(jié)果表明，該菌株在37 ℃、150 r/min、初始 pH值7.0、培養(yǎng)30 h得到的菌液抑菌效果最佳，抑菌率達到了93.12%，抑菌率比優(yōu)化前提高了7.86%。并通過對該菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察、生理生化特性以及16 S rDNA序列分析，對該菌株進行了初步鑒定，該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。試驗結(jié)果為深入研究該菌株的抑菌性能及開發(fā)利用提供了基礎資料。

關鍵詞：致病疫霉；TD-12 菌株菌液；鑒定；發(fā)酵條件

中圖分類號： S435.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0143-04

收稿日期：2015-01-27

基金項目：河北省自然科學基金（編號：C2011201003）。

作者簡介：張蕾（1987—），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士，助理實驗師，從事植物分子生物學研究。E-mail：zhanglei07025@163.com。

通信作者：蔣繼志，教授，博士生導師，從事植物病害生物防治及生物活性物質(zhì)研發(fā)。E-mail：jizhijiang909@163.com。馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄屬的一年生草本塊莖植物，在糧食作物中位居第四，是唯一的糧菜兼用型作物。由致病疫霉[Phytophthora infestans （Mont） de Bary]引起的馬鈴薯晚疫病是引起馬鈴薯產(chǎn)量損失最嚴重的一種病害。由于化學農(nóng)藥的長期大量使用及病菌A2交配型的出現(xiàn)，致使高致病性、高抗藥性菌株不斷出現(xiàn)，造成近幾年晚疫病在馬鈴薯和番茄上大流行，引起了國際社會的極大關注[1]。生產(chǎn)中主要依靠選用抗病品種、農(nóng)業(yè)栽培措施、化學農(nóng)藥來控制該病的發(fā)生[2]，而生物防治因其與環(huán)境友好、維持生態(tài)平衡、有利于人類健康等優(yōu)點，受到越來越多研究者的關注和重視。前人已從多種類型的土壤中篩選得到了一些有明顯抑制致病疫霉生長或誘導馬鈴薯增強抗病性的真菌[3]、細菌[4-5]和放線菌[6]，并對他們產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)[3]、抑菌機理[7]、誘導抗病作用[4-5，8]等進行了研究。但利用茄科植物內(nèi)生菌抑制致病疫霉的報道還比較少。我們在前期研究中篩選出了一些對致病疫霉菌絲生長具有顯著抑制作用的菌株，如分離自馬鈴薯塊莖的TD-12菌株在初期試驗中對致病疫霉菌絲生長表現(xiàn)了強烈的抑制作用，在馬鈴薯離體組織上也展示出了良好的防病作用，其活體對病菌生長的抑制率達到了92.24%，在馬鈴薯塊莖切片和離體葉片上對晚疫病的防效分別達到了 91.00%、76.23%以上[9]。但在后期的重復試驗研究中，發(fā)現(xiàn)該菌株的抑菌率有所下降，抑菌率僅為85.26%。為穩(wěn)定和進一步提高TD-12菌株對致病疫霉的抑制作用，對其部分發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，并對該菌株的分類地位進行了鑒定，以期為今后開發(fā)田間有效控制馬鈴薯晚疫病高效穩(wěn)定的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌種

拮抗細菌TD-12菌株（分離于馬鈴薯塊莖中），致病疫霉菌株[Phytophthora infestans （Mont.） de Bary]Z182，本研究室保存菌株。

1.2TD-12菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1種子液的制備用滅菌竹簽挑取牛肉膏蛋白胨平板上的TD-12菌株的新鮮培養(yǎng)菌落，接種到含有50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，按照1%的比例吸取1 mL到100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后即為種子液。

1.2.2發(fā)酵溫度的確定取TD-12 菌株種子液1 mL接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別在22、25、28、31、34、37、40 ℃條件下振蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 h，采用濾紙片法[10].，測定對致病疫霉生長的抑制作用，參照李麗艷等方法[5]計算抑菌率。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)中轉(zhuǎn)速的確定將TD-12 菌株1 mL的種子液接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，按照上述試驗中已確定的最適培養(yǎng)溫度，分別在50、100、150、200、250 r/min等不同轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)24 h，所得菌液抑菌效果的測定方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.4培養(yǎng)時間的確定取TD-12菌株種子液1 mL接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，按照上述試驗中已確定的最適培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速，分別取在第12、18、24、30、36、42、48 h的菌液進行抑菌試驗，所得菌液抑菌效果的測定方法同“1.2.2”節(jié)。

1.2.5初始pH值的確定用NaOH和HCl將LB液體培養(yǎng)基調(diào)制成pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的培養(yǎng)基，然后將1 mL TD-12菌株的種子液接種到100 mL上述培養(yǎng)基中，按照上述試驗中所確定的最佳發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速以及時間進行發(fā)酵培養(yǎng)，所得菌液抑菌效果的測定方法同“1.2.2”節(jié)。

以上各項試驗條件每組處理重復3次，所得試驗結(jié)果用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

1.3菌株分類地位的確定

1.3.1菌株培養(yǎng)特性及菌體形態(tài)觀察及其染色觀察TD-12菌株在 LB固體培養(yǎng)基上的生長狀況及菌落特征，在光學顯微鏡下觀察菌株菌體的形態(tài)，并參照文獻[11]進行革蘭氏染色和芽孢染色。

1.3.2生理生化特征參照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊的方法[12]，對TD-12菌株分別進行了接觸酶反應、明膠水解、淀粉水解、V-P測定、硝酸鹽還原、酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氫酶、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸利用以及葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖、蔗糖的利用試驗。

1.3.316S rDNA基因序列測定及分析采用SDS法提取菌株TD-12總DNA，采用細菌16S rDNA 擴增通用引物擴增TD-12菌株的基因組DNA，通用引物設計，Primer1：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，Primer2：5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。委托華大基因測序，將所得測序結(jié)果通過Blast軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行對比，選取具有代表性的菌株，采用Mega4.1軟件包中的Phylogeny進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[13]。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)溫度

取TD-12菌株種子液1 mL接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別在22、25、28、31、34、37、40 ℃條件下振蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 h，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對TD-12菌液抑菌率的影響比較明顯（圖1），隨培養(yǎng)溫度升高，抑菌率呈先上升后下降的趨勢，在培養(yǎng)溫度為22 ℃時抑菌率只有42.59%，隨著培養(yǎng)溫度的升高，抑菌率逐漸升高，在培養(yǎng)溫度為37 ℃時抑菌率最高，為90.25%，而在培養(yǎng)濕度為40 ℃時抑菌率顯著下降。分析表明，溫度37 ℃所得抑菌率與其他處理之間差異顯著。表明TD-12菌株的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃，以下試驗培養(yǎng)溫度均選用37 ℃。

2.2振蕩培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)速

振蕩培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)速對TD-12菌液抑菌率的影響見圖2。在轉(zhuǎn)速為50 r/min條件下，所得菌液的抑菌率僅為20%，與靜置培養(yǎng)條件下的抑菌率無明顯差異；當轉(zhuǎn)速在100～200 r/min范圍內(nèi)時，所得菌液均表現(xiàn)出了很強的抑制作用，抑菌率都在70%以上，其中以150～200 r/min條件下所得菌液的抑菌率較高，均在80%以上。在轉(zhuǎn)速為150 r/min時抑菌率最高，為90.52%，在轉(zhuǎn)速為250 r/min時，抑菌率明顯下降，為60%。分析表明，轉(zhuǎn)速150 r/min所得抑菌率與轉(zhuǎn)速50、100、200、250 r/min之間差異極顯著，表明150 r/min是最適條件。

2.3發(fā)酵培養(yǎng)時間

培養(yǎng)時間對抑菌活性的影響結(jié)果見圖3。該菌株在培養(yǎng)時間為12 h時抑菌率最低，只有70%，隨著培養(yǎng)時間的增加，抑菌率逐漸增加，在培養(yǎng)時間為30 h時抑菌率最高，為92%，之后抑菌率隨著培養(yǎng)時間的增加而有所下降。分析表明，培養(yǎng)時間為30 h所得抑菌率與培養(yǎng)12、18、24、36、42、48 h處理間差異顯著。因此，該菌株的最佳發(fā)酵時間為30 h。

2.4培養(yǎng)基初始pH值

從圖4可以看出，在初始pH值為4時，抑菌率最低，只有41%；在初始pH值為6～9時，抑菌率基本穩(wěn)定在90%，其中pH值為7時，抑菌率最高，為93.12%；pH值超過9后，抑菌率急劇下降，當pH值為10、11時，抑菌率分別為74%、58%。分析表明，初始pH值為7時所得抑菌率與其他處理差異顯著，由此確定pH值7為最適的初始pH值。

綜合上述所有優(yōu)化條件，優(yōu)化后的結(jié)果見圖5。優(yōu)化后TD-12菌株菌液對致病疫霉的抑菌率達到了93.12%，比優(yōu)化前85.26%提高了9.22%，表明TD-12菌株有進一步應用潛能。

2.5菌株分類地位的確定

2.5.1培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及染色結(jié)果拮抗菌TD-12在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)呈黃色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則（圖6）。顯微鏡下油鏡觀察細胞呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓形，有運動性。

2.5.2生理生化特征TD-12 菌株的接觸酶反應有氣泡產(chǎn)生，明膠水解、淀粉水解、V-P 反應和硝酸鹽還原均為陽性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氫酶、吲哚產(chǎn)生、檸檬酸利用均為陰性；可利用葡萄糖、D-甘露醇、麥芽糖和蔗糖。綜合 TD-12 菌落特征、培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察和染色結(jié)果，參照東秀珠等的方法[12]，初步推測 TD-12 菌株可能為芽孢桿菌或類芽孢桿菌屬細菌。

2.5.3拮抗菌TD-12菌株的16S rDNA序列分析經(jīng)PCR擴增后得到TD-12菌株16S rDNA的PCR產(chǎn)物為單一條帶，測序結(jié)果表明，TD-12菌株16S rDNA的序列長度為1 432 bp。將該序列在GeneBank/NCBI 中進行序列比對，結(jié)果表明，TD-12菌株與解淀粉芽孢桿菌在同一個分支上，同源性為94%（圖7、圖8），表明TD-12菌株與解淀粉芽孢桿菌親緣關系最近。結(jié)合上述形態(tài)特征、染色結(jié)果和生理生化特性，可以初步確定TD-12菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3討論

微生物在不同生長發(fā)育階段和不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生活性物質(zhì)的種類和數(shù)量均不相同，有時培養(yǎng)條件即使只發(fā)生微小的變化，活性物質(zhì)產(chǎn)生也會受到明顯的影響。因此，確定菌株的最佳發(fā)酵條件對于獲得大量高活性物質(zhì)至關重要。李雙東等從番茄中分離得到內(nèi)生枯草芽孢桿菌EB-28，EB-28無菌體培養(yǎng)液對致病疫霉游動孢子釋放的抑制率達91.26%，但對菌體生長沒有抑制作用，EB-28菌懸液對馬鈴薯晚疫病在離體葉片和盆栽植株上的防病效果分別為55.68%和74.22%[14]。Daayf等篩選得到的芽孢桿菌B.subtilis B1、J1、B3對致病疫霉的抑菌率分別達到81%、79%、76%[15]。姜軍坡等從健康的牛糞便中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌BN-9，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌有較強的抑制作用[16]。Sutyak等從益生菌乳制品中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌，其細胞無菌上清液可以對單核細胞增生李斯特菌、鏈球菌屬及腸道加德菌產(chǎn)生抑制作用，但對腸道乳酸菌不產(chǎn)生作用[17]。此外，于靚等對解淀粉芽孢桿菌T1進行了發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)液中解淀粉芽孢桿菌T1的活菌數(shù)明顯增多，由1.4×109 CFU/mL增至3.5×109 CFU/mL[18]。郭堯等

用濾紙片法以單因子試驗對致病疫霉拮抗放線菌sy11發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后抑菌率達到了90%，比優(yōu)化前提高了約10%[19]。吳真真等對致病疫霉拮抗細菌SR13-2進行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后比優(yōu)化前抑菌率提高了約10%，并且發(fā)現(xiàn)該菌株具有較強的耐熱性和耐酸堿性[20]。

本研究對分離自馬鈴薯塊莖的 TD-12 菌株菌液抑制致病疫霉菌絲生長的部分發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，明確了該菌株的最適發(fā)酵條件為：將1 mL種子液接種到初始 pH值7的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30 h，在此條件下，所得菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制率可達93.12% 優(yōu)化后比優(yōu)化前抑菌率提高了9.22%。該菌株在抑制致病疫霉方面有較大的應用潛力。此外，明確拮抗菌的種類及其分類地位，對開發(fā)生物制劑且應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導意義。本試驗中通過菌體形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌落特征觀察以及生理生化特性的16S rDNA序列分析，將菌株 TD-12 鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。有報道表明，解淀粉芽孢桿菌種內(nèi)的許多菌株對人畜安全，已被越來越多地應用于飼料添加劑和飼用微生態(tài)制劑[13]。與此同時，該細菌種內(nèi)的另外一些菌株展示出了抑制許多植物病原菌的巨大潛力，分離自土壤的1株解淀粉芽孢桿菌 HN06，對黑曲霉（Aspergillus niger）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、苦瓜枯萎病菌（cucurbit wilt）均有良好的抑制作用[21]。上述研究進一步證實，解淀粉芽孢桿菌在植物病害防治方面有廣闊的應用潛力。

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