王平++趙巧巧 +黃鷹

摘要：由于丙酮醛降解酶（methylglyoxal degradation enzyme，MD）是生物體內(nèi)代謝丙酮醛的一種關(guān)鍵酶，實現(xiàn)MD的高效表達對調(diào)控丙酮醛的代謝途徑具有重要意義。所以根據(jù)Schizosaccharomyces pombe_GeneDB中MD的基因序列（SPAC22E12.03C）設(shè)計引物，以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）cDNA文庫為模板通過PCR擴增技術(shù)得到目標(biāo)基因，目的片段全長576 bp。將SPAC22E12.03C連接到pET-28a（+）上，得到重組質(zhì)粒pET-28a（+）-SPAC22E12.03C，并在Escherichia coli BL2l（DE3）中實現(xiàn)表達。同時，對其目的蛋白的表達條件進行了優(yōu)化，獲得最佳表達條件：誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)起始菌體D600 nm為0.5～0.6，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.8 mmol/L。這為研究粟酒裂殖酵母體內(nèi)丙酮醛的降解途徑打下了堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：粟酒裂殖酵母；丙酮醛降解酶；丙酮醛；基因克??；基因表達

中圖分類號： Q785文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）02-0062-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2015-03-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31070703） 。

作者簡介：王平（1990—），女，河南南陽人，碩士研究生，從事粟酒裂殖酵母分子機理研究。E-mail：350479708@qq.com。

通信作者：黃鷹，教授，從事微生物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：paula_wong@163.com。[HJ]

丙酮醛（methylglyoxal）是在糖酵解、脂質(zhì)和氨基酸代謝過程中產(chǎn)生的一種對生物體有毒害作用的代謝物[1-2]，性質(zhì)活躍，屬于α-酮基醛類，由糖酵解的中間產(chǎn)物丙糖磷酸化裂解生成，或由丙酮和氨基丙酮代謝生成[3]。其醛基可與蛋白質(zhì)的氨基基團之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)（又稱Maillard反應(yīng)）[4]形成一系列具有高度活性和高度異質(zhì)性的終產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白功能的修改和缺陷，Ward等研究證實，丙酮醛能通過細胞內(nèi)顆粒釋放而加強應(yīng)激反應(yīng)[5]，并進一步誘導(dǎo)細胞的應(yīng)激反應(yīng)，包括胞吞、細胞因子釋放和細胞凋亡[6]等，丙酮醛在生物體內(nèi)過度累積會導(dǎo)致細胞死亡；此外，丙酮醛與生物體的很多病變有關(guān)，如慢性糖尿病[7-8]、結(jié)腸癌和乳腺癌等。因此，丙酮醛在生物體內(nèi)的累積量必須受到嚴格的控制，丙酮醛降解酶是代謝丙酮醛的一種關(guān)鍵酶，于是對丙酮醛降解酶的研究顯得尤為重要。

近年來，各種慢性病患病率的增加，使得丙酮醛在體內(nèi)的代謝途徑受到越來越多的關(guān)注，丙酮醛代謝相關(guān)酶的研究也成為國際熱點。研究報道在細菌體內(nèi)丙酮醛的降解主要通過3條途徑：（1）依賴于谷胱甘肽的醛酮變位酶Ⅰ和醛酮變位酶Ⅱ[9]；（2）不依賴于谷胱甘肽的醛酮變位酶Ⅲ；（3）依賴于NADPH的醛還原酶和依賴于NADH的乙醇脫氫酶[10]。人體內(nèi)的DJ-1也具有分解丙酮醛的作用，我們以粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為模式生物，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹和基因比對，找到了粟酒裂殖酵母體內(nèi)的能夠降解丙酮醛的酶，即SPAC22E12.03C的產(chǎn)物。

本試驗根據(jù)SPAC22E12.03C的基因序列設(shè)計引物，以粟酒裂殖酵母的cDNA為模板通過PCR擴增技術(shù)得到了目標(biāo)酶的基因，構(gòu)建T7強啟動子表達載體和重組工程菌株，研究丙酮醛降解酶的高效表達，希望以后能夠通過高效表達丙酮醛降解酶來調(diào)控和優(yōu)化丙酮醛的代謝途徑，從而為解決因丙酮醛在體內(nèi)累積過多引起的各種慢性疾病提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

本試驗中所用的菌株名為Escherichia coli BL2l （DE3）、Escherichia coli top10，所用的質(zhì)粒為pET-28a（+），這些材料均為筆者所在實驗室保存。粟酒裂殖酵母cDNA文庫來自美國，重組克隆pET-28a（+）-SPAC22E12.03C為筆者所在實驗室構(gòu)建。

1.2試劑及其來源

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、solutionⅠ[kite code.6022]、rTaq DNA 聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶、蛋白marker、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG），均購自TaKaRa 公司；DNA 割膠回收試劑盒，來源于BioSpin Gel Extraction Kit；PCR過柱純化，來源于BioFLUX BioSpin PCR Purification Kit試劑盒；DNA marker 來源于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由南京思普金生物科技有限公司合成；卡那霉素（Kan）來源于Sigma 公司，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3粟酒裂殖酵母中目的片段SPAC22E12.03C的獲得

根據(jù)S.pombe_GeneDB數(shù)據(jù)庫中的丙酮醛降解酶基因（SPAC22E12.03C）序列設(shè)計上、下游引物，分別為SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]TAAAGGTTTGCCTATTTGTTG-3′，SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]GGGCATACTAAGAGATTTATAGACA-3′ （下劃線分別為NcoⅠ和XhoⅠ酶切識別位點）。以粟酒裂殖酵母cDNA為模板擴增丙酮醛降解酶基因，PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 14.7 μL、5×PS buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL、cDNA模板1 μL、SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up 1 μL、SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down 1 μL、高保真DNA聚合酶 03 μL。[JP3]PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃ 變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。

1.4重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將上述PCR擴增片段SPAC22E12.03C過柱純化后與質(zhì)粒pET-28a （+）雙酶切驗證。酶切位點為NcoⅠ和XhoⅠ。將酶切產(chǎn)物回收得到目的DNA片段與質(zhì)粒pET-28a （+）酶切產(chǎn)物。接下來建立酶連體系為16.6 μL：SPAC22E12.03C目的片段8 μL、pET-28a （+）酶切產(chǎn)物0.3 μL、連接酶（SolutionⅠ） 8.3 μL。16 ℃ 連接4 h，將酶連產(chǎn)物導(dǎo)入到E. coli Top10感受態(tài)細胞中，涂布到含Kan抗性的LB培養(yǎng)基上。隨機挑取轉(zhuǎn)化子提其質(zhì)粒進行酶切驗證，將陽性質(zhì)粒送到南京斯普金科技有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒和pET-28a（+）空載質(zhì)粒分別通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，得到重組表達菌和帶有空載質(zhì)粒的對照菌。

1.5目的蛋白的表達

將得到的重組表達菌和帶有空載質(zhì)粒的對照菌分別接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，其中含有50 mg/L Kan。37 ℃ 220 r/min 恒溫搖床過夜培養(yǎng)之后將重組表達菌和對照菌分別轉(zhuǎn)接至15 mL 同樣含50 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基中，此時菌液D600 nm≈0.2，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)D600 nm達到0.6時，加入1 mmol/L IPTG，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)過夜，次日，4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，收集菌體，用100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH值為7.0）重懸菌體進行洗滌，重復(fù)洗滌3遍后加入適量的緩沖液（包含0.1 mmol/L PMSF和14.3 mmol/L的β-巰基乙醇）置于冰浴中進行超聲波破碎，破碎10 s，冷卻10 s，待菌體破碎完全后，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，收集細胞上清，取適量進行SDS-PAGE，分析目標(biāo)產(chǎn)物表達情況。

1.6目標(biāo)蛋白表達條件的優(yōu)化

優(yōu)化表達條件時分別選擇不同起始誘導(dǎo)菌濃度（D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117）與不同溫度（37、30、25、18 ℃）培養(yǎng)；培養(yǎng)基中添加不同終濃度的IPTG（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個試驗重復(fù)3次。通過SDS-PAGE 、總蛋白含量測定和酶活測定考察培養(yǎng)條件對目的蛋白表達的影響。

1.7酶活測定

酶活測定根據(jù)丙酮醛降解酶在一定溫度條件下能降解丙酮醛，而丙酮醛可以與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成黃橙色的2，4-二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下顯紫紅色，可在540 nm處檢測[11]。反應(yīng)體系是用100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 值為7.0）配制成不同丙酮醛濃度的反應(yīng)液，總體積為200 μL，加入適量的丙酮醛降解酶，在45 ℃反應(yīng)一定時間，加入2，4-二硝基苯肼終止反應(yīng)，室溫下靜置15 min，再加入10%的NaOH，室溫放置15 min后用分光光度計在540 nm處測定吸光度。酶活單位（U）定義為在該反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化降解0.1 μmol丙酮醛所需的酶量。

2結(jié)果與分析

2.1丙酮醛降解酶基因的克隆

以粟酒裂殖酵母cDNA為模板，以SPAC22E12.03C-NcoⅠ-up、 SPAC22E12.03C-XhoⅠ-down為引物進行PCR，擴增獲得1條大于500 bp的DNA產(chǎn)物（圖1），與目的基因576 bp相吻合，過柱純化PCR產(chǎn)物，用NcoⅠ和XhoⅠ對純化后的PCR產(chǎn)物進行雙酶切。

2.2表達載體pET-28a（+）-SPAC22E12.03C的構(gòu)建及驗證

[CM（24]獲得丙酮醛降解酶基因并純化后，將其連接到pET-28a

（+）（NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切）得到pET-28a（+）-SPAC22E12.03C重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化E. coli Top10感受態(tài)細胞，挑選菌落，PCR驗證有條帶的陽性重組子繼續(xù)培養(yǎng)，并提取重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，雙酶切后得到大小分別為500 bp和5 400 bp的條帶，基因片段大小正確。重組質(zhì)粒經(jīng)測序比對與S.pombe_Gene DB上公布的基因序列一致，證明丙酮醛降解酶基因已插入到pET-28a（+）載體中（圖2），成功構(gòu)建了pET-28a（+）-SPAC22E12.03C表達載體。將構(gòu)建成功的pET-28a（+）-SPAC22E12.03C 轉(zhuǎn)入到E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，得到重組菌。

[FK（W14][TPWP2.tif][FK）]

2.3重組菌的誘導(dǎo)表達

重組菌誘導(dǎo)表達經(jīng)SDS-PAGE驗證（圖3），得到分子量大小約為20 ku的重組酶，與目的蛋白S.pombe_GeneDB上公布的21.08 ku相符，證明丙酮醛降解酶得到了表達。

[FK（W10][TPWP3.tif][FK）]

2.4丙酮醛降解酶的優(yōu)化表達

2.4.1溫度對丙酮醛降解酶可溶性表達的影響據(jù)文獻報道，溫度對目的蛋白的可溶性表達有很大的影響[12-13]。選定的條件為：在37、30、25、18 ℃，220 r/min 培養(yǎng)至D600 nm為0.8時，加入1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)4 h。由SDS-PAGE（圖4和表1）分析可得，丙酮醛降解酶在37 ℃培養(yǎng)后上清中可溶蛋白的含量最多，相對沉淀中目的蛋白含量最少，酶活最高?？梢?7 ℃不僅是E. coli BL21的最適生長溫度，并且在這個溫度下有活性的菌和帶外源基因的菌更多，從而表達的目的蛋白也多，且大部分以可溶形式存在，酶的活性也最高。

2.4.2IPTG對丙酮醛降解酶可溶性表達的影響在一定范圍內(nèi)，IPTG 濃度對重組蛋白誘導(dǎo)表達有一定影響[14]，降低表達水平可能提高某些目的蛋白的產(chǎn)量。因此，本試驗選取了5個IPTG濃度，分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。在 37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)D600 nm=0.6時，加入上述不同濃度的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h，分析IPTG濃度對丙酮醛降解酶可溶性表達的影響。表達載體pET28a（+）-SPAC22E12.03C含有T7/Lac 啟動子，受IPTG誘導(dǎo)啟動表達蛋白。當(dāng)IPTG濃度過低時，外源基因不能被完全表達，而高濃度的IPTG將對細胞的生長產(chǎn)生毒害作用，由圖5和表2分析可知，IPTG濃度在0.6～1.0 mmol/L 時，總蛋白量略微升高，此范圍內(nèi)酶的活性也相對較高，但就三者目的蛋白的相對含量分析：0.6 mmol/L時相對含量為74.4%，0.8 mmol/L 時目的蛋白相對含量為77.9%，1.0 mmol/L時相對含量為73.3%，由蛋白相對含量和酶活大小分析可得，0.8 mmol/L時蛋白相對表達含量最高，酶的活性最高，因此選擇0.8 mmol/L作為誘導(dǎo)劑IPTG的最適濃度。

2.4.3誘導(dǎo)起始菌濃度不同對丙酮醛降解酶可溶性表達的影響據(jù)文獻報道，誘導(dǎo)起始菌濃度不同，菌體的生長速率不同，外源蛋白表達水平會受到影響[15]。本試驗選取了6個不同起始菌濃度：D600 nm=0.307，D600 nm=0.455，D600 nm=0.557，D600 nm=0.603，D600 nm=0.805，D600 nm=1.117，加入0.8 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h。由圖6和表3分析可知，隨著誘導(dǎo)起始菌濃度的增加，總蛋白水平在增加，目的蛋白的表達量也有

3結(jié)論

在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗開展了對丙酮醛降解酶基因的克隆及其目的蛋白表達的研究。在對目的基因SPAC22E12.03C進行克隆時，選取的驗證酶切位點為NcoⅠ和XhoⅠ。接下來經(jīng)過酶聯(lián)與轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)測序，確定其為陽性質(zhì)粒。再次經(jīng)過轉(zhuǎn)化，成功得到重組表達菌和帶有空載質(zhì)粒的對照菌。

接下來本試驗采取單因素控制變量法對目的蛋白最佳表達條件的進行了探索。試驗采用的3個變量分別為溫度、誘導(dǎo)劑IPTG、起始誘導(dǎo)菌濃度。檢測最佳條件的3個指標(biāo)為SDS-PAGE、總蛋白含量測定和酶活測定。結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為37 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)起始菌濃度的D600 nm在0.5～0.6時，結(jié)合酶活性分析，目的蛋白相對含量最高。通過對目的蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，為更好地揭示丙酮醛降解酶的作用機理提供了很好的平臺。

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