耿檸波，張海軍,#，王菲迪,2，任曉倩,2，張保琴，陳吉平,*

1.中國科學院大連化學物理研究所分離分析化學重點實驗室，大連116023

2.中國科學院大學，北京100049

代謝組學技術在環(huán)境毒理學研究中的應用

耿檸波1，張海軍1,#，王菲迪1,2，任曉倩1,2，張保琴1，陳吉平1,*

1.中國科學院大連化學物理研究所分離分析化學重點實驗室，大連116023

2.中國科學院大學，北京100049

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的一部分，通過考察機體受刺激后體液或組織中內源性代謝物的動態(tài)變化規(guī)律，并結合生物信息統(tǒng)計方法，可系統(tǒng)全面地揭示內因和外因作用于機體的毒性效應和機制。代謝組學技術具有快速、靈敏度高、選擇性強的特點，逐漸在低劑量環(huán)境污染物長期暴露的毒性效應評估方面發(fā)揮出優(yōu)勢。本文綜述了代謝組學技術的主要研究手段，在毒理學研究中的發(fā)展歷程和優(yōu)點，以及在環(huán)境毒理學研究中的應用及前景展望。重點討論了代謝組學技術在重金屬和持久性有機污染物(POPs)毒性評估以及環(huán)境脅迫耐受性評價中的應用。

代謝組學；環(huán)境毒理學；NMR；LC/GC-MS；環(huán)境脅迫

耿檸波,張海軍,王菲迪,等.代謝組學技術在環(huán)境毒理學研究中的應用[J].生態(tài)毒理學報，2016,11(3):26-35

Geng N B,Zhang H J,Wang F D,et al.A review on the application of metabonomic approaches in environmental toxicology[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):26-35(in Chinese)

環(huán)境毒理學是利用毒理學方法，研究環(huán)境污染物對人體健康的影響及其機理的學科，是毒理學的一個重要分支。其主要任務是研究環(huán)境污染物對機體可能產(chǎn)生的生物效應，作用機理及早期損害的檢測指標。環(huán)境污染物對機體的作用一般具有接觸劑量較小；長時間內反復接觸甚至終生接觸；多種環(huán)境污染物同時作用于機體；接觸的人群易感性差異大等特點，因此外源化合物的低水平長期慢性接觸，將是新世紀中各種環(huán)境污染物對人體影響的基本方式[1]。傳統(tǒng)的毒性測試具有通量低、周期長、敏感度低和資源耗費等特點，顯然不能滿足對這些環(huán)境污染物進行毒性測試的需求。近年來，隨著毒理學新技術的發(fā)展，在毒物的安全性評價方法上，國外發(fā)達國家已經(jīng)逐步實現(xiàn)了從傳統(tǒng)的整體動物試驗到快速、靈敏、高效的替代試驗的轉變。美國科學院發(fā)布的一個報告“21世紀毒理學測試新方法”指出應將新的毒理學評價方法納入未來的毒性測試系統(tǒng)中去，用毒性通路的理念從系統(tǒng)生物學方向來闡述毒物的毒性作用[2]?；蚪M學，蛋白組學和代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，其高通量篩選特征使其在毒物的毒性作用效應和機制研究上具備很大的優(yōu)勢[3]。

代謝組學是研究生物體內源性代謝物的整體及其隨內因和外因變化的科學。代謝物的變化可靈敏地指示和確證外來干擾物在組織和器官水平的毒性效應，某種特定代謝物的蓄積可能標志著某通路的缺陷或某信號響應的激活，而代謝物的動態(tài)變化可以作為毒性損傷的標志物，因此將其用于污染物的毒性評價在技術上是可行的[4]。代謝組學之所以能在毒理學研究中發(fā)揮巨大作用，是基于反映毒性作用的信息能夠在生物體的代謝過程中全面地表現(xiàn)出來。當毒物與細胞或者組織相互作用時，會引起生物體內關鍵代謝過程中內源性物質比例、濃度的變化并通過體液組成的變化反映出來。生物體液的譜圖中所檢測到的是成百上千種指示不同代謝路徑的化合物，這些代謝層面的生物信息能夠很好地表征環(huán)境因素的毒性通路和毒性作用機制。代謝組學技術為生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供了新的思路和平臺，在毒性作用機制研究上具有很大的優(yōu)勢，其全景式高通量篩選特征必將為生物化學測量提供綜合視角，在21世紀毒理學測試中發(fā)揮重要作用。

1 代謝組學的主要研究手段和在毒理學研究中的優(yōu)勢

1.1 代謝組學研究的基本方法

代謝組學是繼基因組學和蛋白組學新發(fā)展起來的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。Fiehn等[5]按照研究目的不同將代謝組學分為4類：代謝物靶標分析(Metabolite Target Analysis)，代謝物輪廓分析(Metabolite Profiling Analysis)，代謝指紋分析(Metabolite Fingerprinting Analysis)和代謝組學(Metabonomics)分析，在后來的研究中又引申出了生物標志物分析(Biomarker Analysis)[6]。先進的分析檢測技術結合化學計量學計算分析方法是代謝組學研究依靠的基本方法。

代謝組學研究依賴于各種高通量的技術平臺，常用的有核磁共振(NMR)、質譜(LC-MS/GC-MS)、生物芯片等。20世紀70年代，代謝組學分析通常采用核磁共振技術。盡管NMR技術存在靈敏度較低，檢測成本較高等不足，但由于其具有可深入物質內部而不破壞樣品的特征和迅速、準確、分辨率高的優(yōu)點，在最初的代謝組學研究中得到了應用。與NMR相比，LC-MS/MS對樣本制備要求不高，且具有靈敏度高、動態(tài)范圍寬、可以檢測樣本中濃度相差較大的代謝物等特點，而且將廣泛適用、分離能力強的LC和靈敏度高、準確性好的MS結合，即可以定量又可以定性，成為代謝組學研究中應用越來越多的技術平臺。作為一項成熟的分析技術，GC-MS的分析靈敏度高，非常適合于揮發(fā)性物質的代謝組學研究，而且GC-MS的最大優(yōu)勢在于化合物結構鑒定可比對標準譜庫。對極性強、揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的物質可通過硅烷化、甲基化和酰基化等衍生化方法改善其揮發(fā)性、峰形、分離度以及靈敏度，在代謝組學研究中被廣泛應用。

1.2 代謝組學在毒理學研究中的發(fā)展歷程

代謝組學最初是由英國帝國理工大學的Jeremy Nicholson教授提出的，到目前為止，代謝組學在毒理學研究中應用最廣泛的是用于藥物毒性效應評價[7-8]。由于代謝組學研究方法可以無損地監(jiān)測機體生理狀態(tài)，動態(tài)評價藥物毒性效應，在藥物毒性效應評估中發(fā)揮了巨大作用。該領域影響最大的工作是由Nicholson團隊所領導的COMET(Consortium for Metabonomic Toxicology)項目[9]，該項目由英國帝國理工學院和5家制藥公司共同完成，用80種已知毒性藥物暴露后大鼠尿液的1H-NMR譜，構建了肝毒性、腎毒性和其他毒性預測分類的專家系統(tǒng)(A Modeling System for Toxicity Prediction)。并用該系統(tǒng)對近70種藥物的肝或腎毒性進行預測，結果表明該系統(tǒng)對肝、腎毒性的預測敏感性分別為67%和41%，而對肝、腎毒性的特異性則分別為77%和100%?？傮w而言，該項目建立了一個預測臨床前候選藥物肝、腎毒性的專家系統(tǒng)，能夠在藥物毒性快速篩選中發(fā)揮功效。

其他研究人員也應用代謝組學技術在藥物毒性評估方面做了一系列相關研究。West等(2010)[10]以胚胎干細胞為模式細胞，對致畸和非致畸類的18種化合物進行代謝組學評價，結果表明致畸類化合物干擾了尿素循環(huán)中精氨酸，天冬氨酸和二甲基精氨酸水平，以及三羧酸循環(huán)中蘋果酸、琥珀酸和異亮氨酸的含量。精氨酸與二甲基精氨酸倍率變化的比值可以成功地區(qū)分強致畸類與非致畸類藥物，小的倍率變化比值(0.91.1)與致畸類藥物有很好的相關性。用這一規(guī)律對8種致畸和非致畸類化合物進行篩查，準確度在88%，表明代謝組學方法應用于化合物毒理評估具有可行性。Coen等(2003)[11]利用高分辨核磁共振技術研究了乙酰氨基酚對大鼠的肝毒性作用。結果表明，高劑量的乙酰氨基酚會增加線粒體甘油三酯和單不飽和脂肪酸的水平，降低多不飽和脂肪酸含量，使線粒體由于過氧化物酶體增殖而發(fā)生功能性障礙；還通過影響線粒體內脂肪酸的β-氧化造成肝損傷；還觀測到肝組織磷脂損耗，葡萄糖和糖原水平降低，而乳酸，丙氨酸和其他氨基酸水平升高等現(xiàn)象。

代謝組學首次應用于環(huán)境毒理學研究起始于Nicholson等[12]采用NMR技術對HgCl2暴露后大鼠血液和尿液的代謝物變化進行檢測，發(fā)現(xiàn)尿液中肌酸酐和檸檬酸含量降低，而葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和乙酸含量升高；血液中乳酸和肌酸酐升高。從代謝物變化得到的結論與組織病理學觀察和尿液中酶活性測定結果一致，同步指示了HgCl2對大鼠的腎損傷作用。自此代謝組學技術逐漸在重金屬的毒性效應評估方面有了廣泛發(fā)展，以英國劍橋大學的Griffin教授為代表的研究團隊相繼做了一系列重金屬毒性效應的代謝組學研究。另一方面，從藥物毒性效應的代謝組學評價逐漸發(fā)展起來的環(huán)境有機污染物毒性評估近年來也得到了發(fā)展，尤其是針對持久性有機物污染物(POPs)的毒性評估，采用代謝組學技術進行研究具有很大優(yōu)勢。1.3 代謝組學應用于環(huán)境毒理學研究的優(yōu)勢

代謝組學是基因組學和蛋白組學的下游學科，代謝物的變化是機體對環(huán)境因素影響的最終應答，由于機體代謝物的變化可靈敏地指示和確證外來干擾在組織和器官水平的毒性效應、以及毒性作用靶位點，因此借助代謝組學技術來評價環(huán)境污染物暴露帶來的毒性效應，并進而推斷其毒性作用的分子機制具有快速、靈敏度高、選擇性強等特點，特別是在低劑量或環(huán)境劑量污染物的毒性效應評估方面具有很大的優(yōu)勢。

代謝組學技術應用于化學物質的毒性效應評估具有快速和高靈敏度的特征。Robertson等(2000)[13]基于核磁共振技術研究了2種肝毒性物質(四氯化碳和α-萘異硫氰酸)和2種腎毒性物質(2-溴乙胺和對氨基苯酚)對Wistar大鼠尿液代謝物組成的影響，與經(jīng)典的毒理學研究方法如臨床化學和顯微鏡觀察相比，代謝組學技術可以快速靈敏地對毒性物質進行篩查，即使在小劑量暴露水平下，肝毒性和腎毒性物質對大鼠尿液代謝譜也有明顯影響。以肝臟膽管毒物α-萘基異硫氰酸酯為例，代謝組學研究顯示：4只低劑量(10 mg·kg-1體重(bw))處理的動物在24 h內都表現(xiàn)出明顯的代謝紊亂，組織病理學只有2只動物(4 d后)表現(xiàn)出變化，臨床化學的方法(血液中膽紅素含量)卻沒有任何變化。中科院水生所研究人員用代謝組學方法評價了微囊藻毒素對肝臟的毒性作用[14]，發(fā)現(xiàn)低劑量給藥時大鼠肝臟在組織學上沒有明顯變化，但從代謝層面上已經(jīng)能引起肝臟的代謝異常：其酪氨酸合成與分解代謝明顯受到抑制，3條膽堿相關代謝途徑被截斷，谷胱甘肽消耗增加，核苷酸的合成紊亂。

代謝組學技術應用于環(huán)境污染物的毒性篩查和評估具有較好的選擇性。英國帝國理工學院的研究人員[15]在對硫代乙酰胺的腎毒性研究中發(fā)現(xiàn)：代謝組學方法能夠明確地將腎乳頭毒性和近端腎小管毒性區(qū)分。用尿液代謝組學方法能夠將肝實質毒性和膽管毒性明顯區(qū)分。Bundy等[16]對3種愛勝蚓屬Eisenia fetida、Eisenia andrei和Eisenia veneta進行了代謝表型的研究，發(fā)現(xiàn)3種蚯蚓組織提取物的代謝表型極為保守，沒有表現(xiàn)出明顯的變化；但3種不同愛勝蚓屬體腔液代謝物譜有明顯的不同。此研究結果表明，在形態(tài)學上很難分辨的蚓屬在相同的生態(tài)環(huán)境中可以用代謝組學的方法明確區(qū)分。

代謝組學技術應用于于亞慢性毒性或低毒性環(huán)境污染物的毒性評價具有很大的優(yōu)勢，是環(huán)境低劑量污染物和復合污染物健康風險評估的有效手段。Spann等[17]研究了環(huán)境劑量Zn(350 mg·kg-1干重(dw))和Cd(1.5 mg·kg-1dw)對河蜆(Corbicula fluminea)的毒性效應，發(fā)現(xiàn)環(huán)境劑量Zn不改變河蜆的代謝，而Cd只影響小河蜆的代謝，表現(xiàn)在氨基酸代謝和能量代謝的改變。Geng等[18]采用基于LC/MS/ MS的代謝組學靶標分析對環(huán)境劑量(<100 μg·L-1)短鏈氯化石蠟(SCCPs)的短期暴露對HepG2細胞的代謝干擾進行了研究，發(fā)現(xiàn)SCCPs暴露促進了細胞內不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸的β氧化，使糖酵解和氨基酸代謝紊亂，谷氨酰胺代謝和尿素循環(huán)上調，并通過改變細胞的氧化還原狀態(tài)影響了細胞的增殖活性。代謝組學技術在污染物聯(lián)合毒性方面也有相關研究，O’Kane等(2013)[19]用低劑量PCB和2,3,7, 8-TCDD(0.1 μg·kg-1TEQ)污染的食物對SD大鼠(Sprague Dawley rat)進行暴露，并對血液小分子代謝物進行UPLC-Q-TOF-MS分析，結果發(fā)現(xiàn)PCB和2, 3,7,8-TCDD即使在小劑量暴露下亦會引起大鼠代謝產(chǎn)物的顯著性變化。對于組成復雜的復合污染物，采用代謝組學進行毒性評估能夠提供指示毒性效應的綜合指標。Huang等[20]采用代謝組學方法對組成復雜的大氣細粒子PM2.5進行體外暴露，并對模式細胞肺上皮細胞(A549)的代謝變化進行研究，發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露影響了A549細胞的三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝和谷胱甘肽代謝。Chen等[21]通過體外實驗對大鼠進行PM2.5暴露發(fā)現(xiàn)低劑量PM2.5暴露能夠引起與氧化損傷相關的不飽和磷脂酰膽堿含量降低，與炎癥相關的溶血磷脂酰膽堿(LPC)顯著減少。

2 代謝組學在環(huán)境毒理學研究中的應用

2.1 代謝組學技術在重金屬毒性評價中的應用

代謝組學技術最早用于環(huán)境污染物的毒性評價是從無機金屬元素開始的，Gibb等[22]通過檢測英國的一些常見無脊椎物種如蚯蚓、土鱉蟲、千足蟲等組織提取物的變化來指示環(huán)境污染情況。如基于核磁共振波譜的代謝組學方法以蚯蚓為模式生物進行Cu和Zn的毒理學研究，發(fā)現(xiàn)組氨酸含量與Cu暴露濃度呈正相關關系，可以作為Cu污染的指示性生物標志物，該研究還發(fā)現(xiàn)Zn是引起7個不同地區(qū)的蚯蚓代謝譜之間差別的主要污染物。Jamers等[23]基于NMR研究了Cu對微藻(Chlamydomonas reinhardtii)的毒性效應，發(fā)現(xiàn)當Cu的濃度達到17 nmol· L-1時，微藻體內谷胱甘肽水平下調。Bundy等[24]研究發(fā)現(xiàn)在無可見毒性效應水平(NOAEL)和最低可見毒性效應水平(LOAEL)下Cu暴露即可對蚯蚓的能量代謝產(chǎn)生干擾。Ritter等[25]同時從基因和代謝的角度研究了Cu脅迫后褐藻(E.siliculosus)的生物化學變化，發(fā)現(xiàn)E.siliculosus自身光合作用改變，小分子代謝物中氧脂素代謝上調，芳香類氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)和支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)的增加意味著蛋白質分解代謝的增加；游離脂肪酸(FFA)尤其是FFAC18:3和FFAC20:4的顯著增加表明ROS參與的脂質過氧化過程增加。從基因分析的結果可以看出，ROS解毒系統(tǒng)和肌醇信號通路被激活。

另外，英國劍橋大學的Griffin教授帶領的研究團隊在重金屬毒性效應的代謝組學評價方面做了一系列的研究工作。Griffin等(2000)[26]觀察到低劑量CdCl2暴露(腎臟濃度為8.4 μg·g-1dw)引起沙鼠的生物化學變化包括脂類和谷氨酸代謝。在另一篇文章中，Griffin等(2001)[27]基于NMR研究了CdCl2暴露對SD(Sprague Dawley)大鼠尿樣的代謝干擾，發(fā)現(xiàn)甘油三酯水平發(fā)生變化，經(jīng)過19 d的暴露，低劑量組和高劑量組(8 mg·kg-1和40 mg·kg-1食物)大鼠均出現(xiàn)肌酸尿和檸檬酸結合物增加的現(xiàn)象。94 d暴露后血液Ca2+/Mg2+降低，另外還發(fā)現(xiàn)Cd暴露會引起腎臟細胞出現(xiàn)酸中毒。Jones等(2007)[28]在研究嚙齒類動物對Cd暴露的代謝響應時也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。Griffin等(2001)[29]基于NMR研究了As2O3(28 mg·kg-1食物)對沙鼠的毒性作用，發(fā)現(xiàn)該劑量As2O3暴露能夠引起腎組織損傷和脂質代謝異常。Wu等[30]基于NMR的代謝組學方法研究了不同鹽度下As暴露對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的毒性效應，發(fā)現(xiàn)在高鹽度下(31.1 μg·L-1)As暴露降低了蛤仔體內氨基酸(如谷氨酸、β-丙氨酸等)的含量，同時增加甜菜堿和延胡索酸的含量；在中等鹽度下(23.3 μg·L-1)，As導致的代謝變化包括蘇氨酸、組氨酸、ATP和延胡索酸的降低；而低鹽度下(15.6 μg·L-1)，只有ATP含量增加，琥珀酸減少。表明低鹽度條件下As暴露改變能量代謝，而中高鹽度條件下除了能量代謝變化，滲透壓也發(fā)生改變。Holmes等(2000)[31]采用基于HMR的代謝組學技術尋找肝毒性(聯(lián)肼)和腎毒性物質(HgCl2)對大鼠毒性作用的標志物，尿樣中?；撬?、α-丙氨酸、肌酸和2-氨基己二酸水平的升高可以作為聯(lián)肼肝毒性的標志，而尿樣中氨基酸、有機酸和葡萄糖水平升高，同時檸檬酸、琥珀酸、馬尿酸和2-氧戊二酸的降低可以作為HgCl2腎損傷的標識。

Sun等(2010)[32]利用GC-TOF-MS技術系統(tǒng)研究了鎘脅迫對擬南芥小分子代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)鎘脅迫可以引發(fā)一系列誘導反應，β-丙氨酸、脯氨酸、腐胺、4-氨基丁酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉子糖、a-生育醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和異黃酮等化合物均有顯著升高，并首次發(fā)現(xiàn)鎘脅迫顯著影響擬南芥中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量。Lenz等[33]同時用NMR和HPLC-TOF/MS對HgCl2暴露后大鼠尿液中代謝物的變化進行研究，在暴露后的時間序列變化中NMR和HPLC-TOF/MS分析均發(fā)現(xiàn)HgCl2暴露對大鼠的顯著干擾發(fā)生在暴露后第3天，NMR和HPLC-TOF/MS鑒定出的代謝物有所不同，二者在代謝組學研究中可以相互補充。Dudka等[34]采集了健康人群和長期暴露于重金屬As、Cd和Pb的職業(yè)工人尿液，并基于NMR對其小分子代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)As、Cd和Pb的聯(lián)合暴露顯著改變了人體的能量代謝，另外，以極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白為代表的脂類物質和氨基酸類物質也發(fā)生顯著變化。Bundy等[35]研究了在不同程度金屬污染的環(huán)境中一種蚯蚓種屬(Lumbricus rubellus)的代謝物變化，發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內麥芽糖含量的升高可作為指示金屬污染的潛在生物標志物。Wu等[36]用代謝組學方法對稀土Ce(NO3)3的急性毒性進行了研究，發(fā)現(xiàn)Ce(NO3)3使大鼠脂肪酸β氧化功能受到抑制，表現(xiàn)為大鼠尿液中一系列小分子代謝物出現(xiàn)劑量依賴性減少，血清中的丙酮、乙酰乙酸、乳酸鹽和肌酸酐升高。Zhu等[37]基于NMR分析了健康人群和接觸高硒環(huán)境的人群尿液代謝譜的變化，發(fā)現(xiàn)過度硒接觸會引起尿液中甲酸、乙酸、乳酸、馬尿酸和丙氨酸含量的升高，同時檸檬酸、肌酸和氧化三甲胺的含量降低，這些顯著變化的代謝物與腎臟和肝臟病變有關。

2.2 代謝組學技術在有機化合物毒性評價中的應用

近年來，也有報道用代謝組學技術研究有機化合物的毒性效應。Vulimiri等(2011)[38]認為代謝組學方法在外源性物質的毒性作用方式研究方面具有獨有的優(yōu)勢。并以四氯化碳為例詳細闡述了其毒性作用機制為CCl4被細胞色素P450酶代謝形成的·CCl3自由基，與氧結合形成的自由基·O-O-CCl3能夠氧化內質網(wǎng)或者細胞膜的多不飽和脂肪酸，并開啟一個脂質過氧化的自催化過程，形成更多的自由基帶來細胞膜損傷。Garrod等[39]用代謝組學的方法研究了2-溴乙胺的肝毒性和腎毒性，暴露后6 h和12 h均發(fā)現(xiàn)腎乳頭滲透因子如甘油磷酰膽堿、甜菜堿和肌醇降低，伴隨肌酸含量升高。暴露后4 h和6 h，發(fā)現(xiàn)各個組織戊二酸水平增加。這一結果表明線粒體脂酰輔酶脫氫酶被抑制導致線粒體功能紊亂。暴露后6 h，腎皮質氧化三甲胺水平增加，肝組織代謝物譜的變化表現(xiàn)在甘油三脂、賴氨酸和亮氨酸增加。Waters等[40]對α-萘基異硫氰酸酯(ANIT)對雌性HW大鼠(Han-Wistar Rat)的毒性作用進行了代謝組學評價，綜合分析了肝臟、血液和尿液的小分子代謝物，發(fā)現(xiàn)ANIT導致的代謝紊亂包括與脂沉積癥相關的高血脂、高血糖和尿糖；肝臟膽汁酸增加，?；撬岷图∷岬哪蛞号判沽吭黾?；另外，血液尿酮增加，通過尿液排泄的三羧酸循環(huán)中間體如琥珀酸、2-氧戊二酸和檸檬酸降低表明能量代謝發(fā)生改變。Garrod等[41]研究了單劑量聯(lián)肼暴露(90 mg·kg-1bw)對SD大鼠的毒性作用，24 h后，測得肝組織中甘油三酯、β-丙氨酸含量顯著增加，同時肝糖原、葡萄糖、膽堿、牛磺酸和氧化三甲胺水平降低。

持久性有機污染物(POPs)具有亞慢性毒性，采用代謝組學對其毒性效應進行評估能夠進一步認識其毒性作用機制。Jones等(2008)[42]用代謝組學方法研究了蚯蚓(L.rubellus)對多環(huán)芳烴(芘)暴露的響應，發(fā)現(xiàn)暴露劑量在40 mg·kg-1時蚯蚓體內乳酸和飽和脂肪酸水平下降，氨基酸水平升高，表明葡萄糖代謝和三羧酸循環(huán)受到干擾，脂肪酸代謝增加。Whitfield ?slund等[43]將蚯蚓(Eisenia fetida)暴露于亞致死劑量的多氯聯(lián)苯，發(fā)現(xiàn)高劑量組蚯蚓的代謝譜中ATP和多種氨基酸含量顯著升高，葡萄糖和麥芽糖顯著降低，蚯蚓的能量代謝和細胞膜滲透功能發(fā)生改變。Zhang等(2012)[44]基于LC-MS/MS研究了2,3,7,8-TCDD短期暴露對HepG2細胞內小分子代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)TCDD使HepG2細胞內脯氨酸和谷氨酸的合成能力下降，另外TCDD可刺激HepG2細胞對纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的吸收。Ji等(2013)[45]研究了蚯蚓(Eisenia fetida)對PBDE的代謝干擾，發(fā)現(xiàn)BDE47主要干擾能量代謝，引起滲透壓改變。代謝干擾的標志物有甜菜堿、甘氨酸、2-己基-5-乙基-3-呋喃硫酸鈉。Lankadurai等(2012)[46]研究了蚯蚓(Eisenia fetida)對PFOA和PFOS的代謝干擾，PFOA暴露濃度為6.25到50 μg·cm-2，PFOS暴露濃度為3.125到25 μg·cm-2。發(fā)現(xiàn)亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、麥芽糖和ATP是PFOA和PFOS暴露的潛在指示物。PFOA和PFOS暴露還會損傷線粒體內膜結構，從而增加脂肪酸氧化，干擾ATP合成。Zeng等(2013)[47]研究了BPA(1、10和100 μg·kg-1bw)對SD大鼠尿液代謝物的干擾，42種代謝物發(fā)生顯著變化，受到影響的代謝通路包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，谷氨酰胺和谷氨酸代謝等。神經(jīng)遞質以及與神經(jīng)傳遞相關代謝物的改變表明小劑量BPA的毒性作用在于干擾神經(jīng)系統(tǒng)。陳蓉等[48]基于LC-MS研究了多氯聯(lián)苯(PCBs)和二噁英(2,3,7,8-TCDD)及其聯(lián)合染毒對大鼠的代謝影響，暴露劑量為TCDD(10 μg·kg-1bw)、PCBs(10 mg·kg-1bw)及其混合溶液(10 μg·kg-1bw TCDD和10 mg·kg-1bw PCB)，其毒性大小為：聯(lián)合染毒>TCDD>PCBs，PCBs和TCDD能導致免疫系統(tǒng)、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)障礙、干擾脂代謝。

2.3 代謝組學技術在環(huán)境脅迫耐受性評價中的應用

環(huán)境脅迫如溫度劇烈變化、缺氧、干旱、饑餓等因素均可引起機體的應激反應，目前研究人員已經(jīng)以不同植物(擬南芥、藻類、狗牙根、復原草、豆科植物、云杉)和動物(麻蠅、果蠅、魚類、蚯蚓和人體)為模式生物開展了一系列代謝組學研究。發(fā)現(xiàn)代謝組學方法可以實時監(jiān)測這些環(huán)境脅迫所導致的生物體變化。Vaclavik等[49]基于LC-MS和DART-MS研究了擬南芥的低溫耐受性，發(fā)現(xiàn)3-丁烯基硫甙為冷敏感性物質，而黃酮甙類物質(flavon-3-ol glycosides)為冷耐受性物質。Nair等[50]基于代謝組學和轉錄組學研究發(fā)現(xiàn)添加LPC后能夠增加擬南芥細胞液中水溶性糖、糖醇、有機酸以及脂肪酸的含量來對抗寒冷，轉錄組發(fā)現(xiàn)的變化也證明了這個規(guī)律。Shi等[51]利用代謝組學和蛋白組學對CaCl2在狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers.)應對寒冷環(huán)境中的作用做了研究，發(fā)現(xiàn)CaCl2能夠通過激活抗氧化劑，調整相關差異表達蛋白和代謝穩(wěn)態(tài)來應對寒冷。具體表現(xiàn)在CaCl2處理后狗牙根體內由寒冷導致的活性氧(ROS)和細胞損傷減輕；與氧化還原反應、三羧酸循環(huán)、糖酵解、光合作用、氧化磷酸戊糖途徑和氨基酸代謝相關的51個蛋白上調；42個小分子代謝物包括氨基酸、有機酸、糖和糖醇發(fā)生顯著變化。Angelcheva等[52]采用GC-MS研究了西伯利亞云杉在適應寒冷不同階段的代謝變化，正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)表明不同適應期(預適應期、適應前期、適應后期和完全適應期)云杉針葉的代謝物譜能夠完全分離，糖類和脂類代謝物變化最為明顯，包括棉子糖中低聚糖的合成和積累增加，糖酸和糖醇以及雙半乳糖甘油增加，長鏈單不飽和、多不飽和脂肪酸在適應過程中也逐步增加。

Zhang等(2011)[53]利用GC-TOF-MS結合LCMS/MS研究了硫缺乏對擬南芥代謝輪廓的影響，共鑒定出90個代謝物，其中有31個代謝物對硫缺乏表現(xiàn)出特征響應，含量呈現(xiàn)明顯增加，而鳥氨酸和果糖含量顯著降低。Ren等[54]通過基因敲除探討了Slr1909在集胞藍藻(PCC6803)對酸容忍性調節(jié)中的作用，蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)Slr1909缺失的藍藻中有24種蛋白顯著上調，10種蛋白顯著下調，代謝組學研究發(fā)現(xiàn)單糖和脂肪酸是區(qū)分Slr1909缺失藍藻和正常藍藻對酸容忍度不同的關鍵代謝物。Yobi等[55]基于GC-MS和LC-MS研究了復原草的耐干旱機制，發(fā)現(xiàn)在干旱狀態(tài)下富氮氨基酸和γ-谷酰基氨基酸、瓜氨酸、核苷酸分解代謝產(chǎn)物如尿囊素含量的增加能夠在水合過程和活性氧去除過程中發(fā)揮重要作用；另外，紫外保護化合物如3-(3-羥苯基)丙酸酯、芹黃素和4,5,7-三羥黃烷酮豐度增加，而除磷酸膽堿之外的大多數(shù)脂類化合物含量減少有助于細胞膜的水合穩(wěn)定?？傮w而言，高豐度糖、滲透壓調節(jié)物質、抗氧化劑、遮光劑共同促進了復原草的耐脫水性。Nguyen等[56]用基因敲除法研究了MtP5CS3基因在豆科植物蒺藜苜蓿的高耐性中發(fā)揮的作用，代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸、糖類、多元醇等物質在蒺藜苜蓿根部的大量富集以及另外一些氨基酸在干旱和高鹽脅迫下含量的降低增加了MtP5CS3基因突變種蒺藜苜蓿的高耐性，但是這些代謝改變彌補不了MtP5CS3基因缺失帶來的脯氨酸缺乏故而使蒺藜苜蓿耐受性減弱。

Teets等[57]采用基因組學和代謝組學研究了麻蠅耐寒的分子生物學機制，細胞分子支架重組(相關基因上調)和細胞信號通路協(xié)調(相關代謝改變)是麻蠅應對寒冷損傷的主要機制。Coquin等[58]通過對果蠅的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)：隨著年齡增加，果蠅對低氧忍受能力降低主要是ATP產(chǎn)生降低，這與線粒體呼吸作用的減弱和對伴隨乙酸生成的能量代謝途徑的過分依賴有關。Feala等[59]在代謝組學研究中發(fā)現(xiàn)在低氧條件下果蠅體內乳酸、丙氨酸和乙酸含量增加。Viant等[60]基于NMR研究了虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)在熱應激下的代謝反應，發(fā)現(xiàn)熱應激蛋白hsp72和hsp89的表達增加與能量代謝物質如磷酸肌酸、三磷酸腺苷和糖原含量的降低呈正相關關系。Warne等[61]對2種蚯蚓(Eisenia veneta和Lumbricus terrestris)應對饑餓脅迫的代謝變化進行了研究，E.veneta在饑餓脅迫5 d內代謝物變化很小，但是第6、7天出現(xiàn)代謝物顯著變化：包括谷氨酸、檸檬酸、天冬氨酸、異亮氨酸含量的增加以及賴氨酸、纈氨酸和蘇氨酸含量的降低；而L.terrestris在短期饑餓脅迫期間小分子代謝物沒有顯著變化，L. terrestris的這一特征更適用于土壤的毒理學研究。Spegel等[62]對口服葡萄糖耐量試驗后2 h內人體血漿的代謝譜變化進行分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸和氨基酸含量均顯著降低，但是由于影響氨基酸變化的生物學因素很多，故脂肪酸被認為代謝調整的指示物。

3 展望

近年來，代謝組學依賴高通量、高分辨率的分析技術與完整的生物信息學系統(tǒng)相結合，在環(huán)境毒理學研究中得到了快速發(fā)展，為人們更加清楚地認識機體應對環(huán)境因素變化的機理提供了一種新的有效的手段。但到目前為止代謝組學應用于環(huán)境毒理學尚存在以下不足：

(1)先進的代謝組學分析技術多掌握在分析化學家手中，而代謝物變化所指示的生物學意義卻更為生物學家所熟知，這在一定程度上限制了代謝組學在環(huán)境毒理學研究中的應用，所以代謝組學生物信息學這一交叉學科的發(fā)展，能夠為代謝組學在各個學科中的應用提供更廣闊的空間。

(2)代謝組學在環(huán)境毒理學中的應用還缺乏規(guī)范性的指導方針。目前還未建立環(huán)境污染物低劑量長期暴露和不同靶器官毒性物質毒性效應評估的試驗規(guī)范：包括模式生物選擇(體內和體外)、暴露方式確定(暴露劑量和暴露時間)、高通量代謝組學方法建立和代謝產(chǎn)物鑒定、以及針對不同模式生物代謝變化的系統(tǒng)生物學解析。這一系統(tǒng)工作尚需長期的研究和探索。

(3)代謝組學研究需要與傳統(tǒng)毒理學方法相結合，借助傳統(tǒng)毒理學的毒性終點有助于尋找污染物暴露的生物標志物，建立針對不同種類毒性物質的代謝物靶標分析方法和生物標志物指示體系。另外，代謝組學與基因組學和蛋白組學相結合，將會成為一種有力的工具，其高通量篩選特征必將為毒理學風險評估提供綜合視角，成為毒理學發(fā)展的必然趨勢。

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A Review on the Application of Metabonomic Approaches in Environmental Toxicology

Geng Ningbo1,Zhang Haijun1,#,Wang Feidi1,2,Ren Xiaoqian1,2,Zhang Baoqin1,Chen Jiping1,*

1.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023,China
2.Graduate School of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China

18 January 2016 accepted 18 February 2016

Metabolomics is an important aspect of systems biology.It concerns with the dynamic changes of endogenous metabolites in body fluids or tissues of organism affected by internal and external factors.Bioinformatic tools are then employed to bring insights into the pathophysiological processes and toxicological mechanisms. Metabolomics is a fast and high-throughput method with the characteristics of high sensitivity and selectivity,and so it plays an increasing advantage in the toxicity assessment of low-dose environment pollutants.In this review, the analytical methods,development history and advantage of metabolomics on toxicology research,as well as its application and perspective in environmental toxicology were introduced.This review mainly focused on the application of metabolomics approach in the risk assessment of heavy metals and persistent organic pollutants(POPs),and the metabolomic responses of orgnisms to environmental stress.

metabonomics;environmental toxicology;NMR;LC/GC-MS;environmental stress

2016-01-18 錄用日期：2016-02-18

1673-5897（2016）3-026-10

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20160118001

簡介：陳吉平(1964-)，男，分析化學博士，研究員，主要從事環(huán)境分析化學與環(huán)境健康相關的基礎與應用研究，發(fā)表學術論文100余篇。

張海軍(1974-)，男，生態(tài)學博士，研究員，主要從事環(huán)境化學與環(huán)境毒理學相關的研究工作，發(fā)表學術論文70余篇。

國家自然科學基金委聯(lián)合重大研究計劃(91543201)；國家自然科學基金(21277141，21337002)

耿檸波(1985-)，女，博士研究生，研究方向為環(huán)境毒理學，E-mail:gengningbo@dicp.ac.cn

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:chenjp@dicp.ac.cn；

#共同通訊作者(Co-corresponding author)，E-mail:hjzhang@dicp.ac.cn；