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        體外受精-胚胎移植周期中單原核(1PN)胚胎的研究進展

        2016-04-09 00:07:03張亞楠殷寶莉張翠蓮姜李樂韋多謝娟珂
        生殖醫(yī)學雜志 2016年5期
        關(guān)鍵詞:整倍體二倍體原核

        張亞楠,殷寶莉,張翠蓮,姜李樂,韋多,謝娟珂

        (鄭州大學人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學研究所,鄭州 450003)

        體外受精-胚胎移植周期中單原核(1PN)胚胎的研究進展

        張亞楠,殷寶莉,張翠蓮*,姜李樂,韋多,謝娟珂

        (鄭州大學人民醫(yī)院/河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學研究所,鄭州450003)

        【摘要】在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中,常常有單原核(1PN)胚胎出現(xiàn)。這類胚胎最終發(fā)展為非整倍體的比例偏高,胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局極差。本文對近年來國內(nèi)外有關(guān)1PN胚胎的研究進行總結(jié),認為1PN胚胎的形成可能有多種機制,但尚無明確定論。因1PN胚胎的染色體組成多異常,多數(shù)研究不建議移植1PN胚胎;然而,國內(nèi)外也有不少研究已證實,1PN胚胎中染色體正常者也占有一定比例,尤其是IVF-1PN胚胎,可能是正常受精的胚胎,移植IVF-1PN胚胎可獲得健康的子代個體。因此,在臨床工作中,對于那些無可利用胚胎的患者,在充分告知患者知情同意后,選擇IVF-1PN胚胎進行移植不失為一個選擇。

        【關(guān)鍵詞】1PN胚胎;體外受精;卵胞漿內(nèi)單精子注射;染色體;非整倍體

        (J Reprod Med 2016,25(5):473-477)

        體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中,常規(guī)于授精后16~18 h對胚胎的受精情況進行觀察[1]。目前,國內(nèi)外專家普遍認同的正常受精的判斷標準為:授精后16~18 h觀察到胚胎內(nèi)存在明確的雙原核(2PN)及雙極體(2PB)[2]。然而,在實際的胚胎培養(yǎng)過程中,常有較多的異常受精出現(xiàn),其中單原核(1PN)的發(fā)生率約為2%~5%[3],因1PN胚胎的非整倍體比例較高而常視為異常受精胚胎,與多原核胚胎及發(fā)育停滯的2PN胚胎一起作為廢棄胚胎被銷毀。事實上,部分1PN胚胎為正常受精的二倍體胚胎,若將這類胚胎全部廢棄,在一定程度上會造成胚胎資源的浪費。

        2012年《河南醫(yī)學研究》雜志發(fā)表了一篇關(guān)于IVF-ET周期中1PN及0PN胚胎的非整倍體性的綜述,主要闡述了1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎的形成機制和染色體組成[3]。近期,關(guān)于1PN胚胎的研究又有了一些新的進展,故本文對近些年國內(nèi)外關(guān)于1PN胚胎的研究發(fā)現(xiàn)進行總結(jié),主要就其形成機制及染色體組成、是否可供移植及應(yīng)用等方面予以綜述,為臨床決策提供證據(jù)支持。

        一、1PN胚胎的形成機制

        受精后的卵母細胞于正常情況下出現(xiàn)2個原核,即雄原核和雌原核。而在實際工作中,原核評分時常觀察到僅有1個原核的胚胎,即1PN胚胎。關(guān)于1PN胚胎發(fā)生的具體機制尚不明確,目前國內(nèi)外學者普遍認為1PN胚胎的形成主要包括以下機制。

        1. 孤雌激活(parthenogenetic activation):與常規(guī)IVF比較,ICSI-1PN胚胎更可能是由于孤雌激活所致,而非正常受精[4]。

        2. 精子染色體解聚異常:精子染色體解聚異常時,進入卵母細胞中的精子可激活,但雄原核的形成受阻。若在ICSI操作過程中對精子膜進行部分破壞,可以確保精子染色質(zhì)的正常解聚,降低1PN胚胎的形成[5]。

        3. 雌雄原核形成不同步(asynchronously):正常情況下,雌雄原核的形成是同步發(fā)生的。若雌雄原核形成不同步,則一般于原核觀察10~120 min后可觀察到第二個原核[6]。

        4. 雌雄原核融合:精卵在體外結(jié)合后,如果受精提前,或是雌雄原核在原核膜形成前就已融合,將在進行原核評分時就只能觀察到一個原核,這類胚胎為正常受精胚胎[7]。

        5. 雌原核形成異常:導致雌原核形成異常的原因可能是ICSI注射過程破壞了減數(shù)分裂的紡錘體,抑制了雌原核的形成,也可能是某些內(nèi)外因素導致第二極體滯留所致[8]。除此之外,卵母細胞激活障礙,紡錘體及星狀體缺陷也是雌原核形成障礙的重要因素[9]。

        6. 成熟前原核核膜破裂(premature pronuclear envelope breakdown,pPNBD)和原核分裂(karyokinesis):在IVF-ET過程中,常于授精后的23~46 h發(fā)生原核核膜的破裂,父源染色體與母源染色體立即發(fā)生融合,原核核膜破裂的機制尚不清楚[10]。若原核核膜提前破裂,在觀察原核時可能看到胚胎只有一個原核,Azevedo等[11]采用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)聯(lián)合免疫細胞化學檢測的方法,證實了原核核膜的提前破裂可能是導致部分1PN胚胎形成的原因。此外,該研究還發(fā)現(xiàn)了部分1PN胚胎有兩個單倍體的雌原核和一個單倍體的雄原核,并且雄原核和其中一個雌原核發(fā)生了pPNBD,出現(xiàn)兩個雌原核的原因可能是雌原核分裂形成。上述機制仍需進一步的研究證實。

        1PN胚胎的形成除上述機制外,還受到其他因素的影響。通過比較1PN周期和非1PN周期發(fā)現(xiàn),1PN胚胎的形成與患者的一般情況、卵巢刺激方案、胚胎學特征及臨床結(jié)局無關(guān)[12-16],而與排卵延遲、卵母細胞過熟及培養(yǎng)液中的Ca2+濃度有關(guān)[17]。此外,精子的來源也可能會對1PN胚胎的產(chǎn)生造成一定影響。Anderson等[18]研究發(fā)現(xiàn),在ICSI周期中,射精組1PN的發(fā)生率為2.9%,手術(shù)取精組的發(fā)生率為6.1%,這可能是因為手術(shù)取出的精子沒有經(jīng)歷正常的成熟過程,未成熟精子不易解螺旋所致。Balakier等[19]則發(fā)現(xiàn)在1PN胚胎周期中,往往有較多的卵母細胞數(shù)及較高的臨床妊娠率。

        二、1PN胚胎是否具有臨床價值

        1. 1PN胚胎中的單倍體和二倍體:目前,國內(nèi)外許多學者對1PN胚胎的染色體進行了研究,然而,各文獻中1PN胚胎的單倍體和二倍體的發(fā)生率不一。Van等[20]對IVF/ICSI-1PN胚胎進行FISH后發(fā)現(xiàn),IVF-1PN胚胎的性染色體二倍體率為54.35%,單倍體率為23.91%,嵌合體率為21.74%,而在ICSI-1PN胚胎則分別為34.62%、34.61%和30.77%,結(jié)果與先前的研究[12,14]相似,即無論采用細胞基因?qū)W技術(shù)還是FISH,IVF-1PN胚胎的二倍體均率明顯高于ICSI-1PN胚胎,說明不同的授精方式在1PN胚胎的染色體組成上起著非常重要的作用,IVF-1PN胚胎較ICSI-1PN胚胎更可能為二倍體。Macas等[15]的研究甚至發(fā)現(xiàn),ICSI-1PN胚胎并無二倍體。Staessen等[16]的研究結(jié)果則與此不同:對1PN胚胎進行FISH發(fā)現(xiàn),無論是IVF-1PN胚胎,還是ICSI-1PN胚胎,均只有一小部分為二倍體。另有研究認為無論是采用細胞基因?qū)W檢查聯(lián)合FISH[19],還是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)聯(lián)合FISH[13],均發(fā)現(xiàn)IVF-1PN胚胎的二倍體率較低。

        上述研究的結(jié)果并不一致,導致這些差異的原因可能與采用的方法、胚胎發(fā)育天數(shù)、檢測染色體數(shù)目,以及分類標準的不同有關(guān)。然而,在所有的研究中,無論IVF-1PN胚胎的二倍體率高或是低,IVF-1PN胚胎的二倍體率均高于ICSI-1PN胚胎,原因是ICSI-1PN胚胎更可能是非受精胚胎。ICSI操作過程中可能會破壞減數(shù)分裂的紡錘體,抑制雌原核的形成,從而形成1PN胚胎;更多的是ICSI顯微注射時的機械刺激使得卵母細胞發(fā)生孤雌激活,即使染色體組成為二倍體,也不能認為其是正常受精的二倍體胚胎。同時,ICSI較常規(guī)IVF而言,培養(yǎng)液中的Ca2+濃度及精子的解螺旋能力發(fā)生了更多的改變,更易形成1PN胚胎。根據(jù)1PN胚胎的形成機制及IVF/ICSI的操作特點,可以認為,IVF-1PN胚胎染色體正常的幾率更大。

        2. 1PN胚胎能否移植:在臨床工作中,經(jīng)常會有一些患者因無可利用胚胎形成而取消周期,這給患者精神上帶來很大的痛苦和壓力。而在這些患者中,常有第2天(D2)/D3發(fā)育為形態(tài)學上均一、無碎片或碎片少的4/8-細胞的1PN胚胎。對于這類胚胎能否進行移植研究者各抒己見。

        有學者認為,這類胚胎常存在染色體非整倍體異常,總體胚胎質(zhì)量較差,發(fā)育潛能較低,出現(xiàn)胚胎停育的幾率較大,故不具有移植價值。即使對其進行移植,也容易發(fā)生流產(chǎn)、死胎、發(fā)育停滯等狀況。正常情況下,雌雄原核最遲出現(xiàn)在授精后20 h,雌雄原核同步形成的發(fā)生率約為63%~74%,若形成不同步,則雄原核先出現(xiàn),10~120 min后可觀察到雌原核。故Azevedo等[11]對授精后24 h的卵母細胞進行觀察,以確保無雌雄原核形成不同步的現(xiàn)象,研究采用FISH分析IVF/ICSI周期中1PN胚胎的染色體組成,發(fā)現(xiàn)1PN胚胎的發(fā)生率約為2.7%~17%,同時1PN胚胎的二倍體率也較低,故不建議移植1PN胚胎。國內(nèi)外其他一些學者也得到了類似的結(jié)論[21-22]。Reichman等[23]對IVF/ICSI-1PN胚胎研究發(fā)現(xiàn),與2PN胚胎相比,1PN胚胎發(fā)育至第3天時,卵裂球數(shù)目較少,發(fā)育速度緩慢,且碎片比例較高,細胞對稱性差,對98個1PN胚胎進行移植后,種植率為6.4%,最終活產(chǎn)1女嬰,活產(chǎn)率為1.3%。與2PN胚胎的種植率和妊娠率比較后發(fā)現(xiàn),1PN胚胎的利用價值非常低。因此,雖然對部分患者移植1PN胚胎后有健康子代出生,但由于其種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率極低,故臨床上仍不建議移植1PN胚胎。

        事實上,1PN胚胎在一定程度上可能是正常受精的胚胎,可能是錯過了最佳的觀察時機,或者是因為雌雄原核形成不同步或雌雄原核融合等原因,導致在進行原核評分時只觀察到一個原核。通過以上的討論,可以得出,IVF-1PN胚胎較ICSI-1PN胚胎染色體正常的幾率更大,即使是二倍體的ICSI-1PN胚胎,也可能為孤雌激活而非正常受精。因此,如果這類胚胎能夠移植,建議移植IVF-1PN胚胎,而不能移植ICSI-1PN胚胎。國內(nèi)外有不少學者持相同觀點,認為可人為地通過各種檢測手段篩選出染色體正常的IVF-1PN胚胎進行移植,以增加困難患者臨床妊娠的概率。目前已有不少1PN胚胎活產(chǎn)的案例報道,且隨訪結(jié)果顯示,與2PN胚胎相比,移植IVF-1PN胚胎活產(chǎn)的子代并無異常[23-26]。

        已有研究證實,IVF-1PN胚胎可能為正常受精的二倍體胚胎。然而,其染色體組成的正常與否無法簡單地依靠形態(tài)學特征進行區(qū)分,所以應(yīng)尋找有效的篩選正常染色體的方法來改善IVF的臨床結(jié)局。通過囊胚培養(yǎng)可篩選出具有高發(fā)育潛能的染色體正常的1PN胚胎[24],提高卵母細胞的利用率,改善困難患者的周期結(jié)局,但1PN胚胎的囊胚形成率往往較低[27]。Liao等[28]對1PN胚胎進行了系統(tǒng)的細胞基因?qū)W檢測后發(fā)現(xiàn),囊胚組1PN胚胎的二倍體率明顯高于卵裂期胚胎組,說明囊胚的形成過程可排除部分染色體異常的胚胎,Sandalinas等[29]的研究結(jié)果與其一致,故囊胚的形成可作為正常受精和染色體正常的一個重要的形態(tài)學指標。通過囊胚培養(yǎng)可在一定程度上有效地篩選出染色體正常的胚胎。然而,研究同時也發(fā)現(xiàn)了1PN囊胚的嵌合體及非整倍體發(fā)生率與1PN卵裂期胚胎的相似[28],說明囊胚培養(yǎng)并不能排除這兩類異常胚胎。故臨床上可通過對1PN胚胎行囊胚培養(yǎng)來篩選正常胚胎進行移植,但必須嚴格地進行產(chǎn)前檢查,以便及早發(fā)現(xiàn)異常胎兒。

        3. 1PN胚胎在其他方面的應(yīng)用:隨著干細胞研究的快速進展,干細胞的來源也越來越廣。目前,有學者采用孤雌激活的1PN胚胎來建立新的胚胎干細胞系,并取得了一定成果。Lin等[30]于2007年報道了第1例應(yīng)用IVF/ICSI周期中孤雌激活來源的1PN胚胎建立人類胚胎干細胞系,其表達的分子標記和基因與正常胚胎干細胞相同,經(jīng)過50余代的傳代培養(yǎng)后,細胞仍未發(fā)生分化,保持一個穩(wěn)定的染色體核型:46,XX。采用全基因組單核苷酸多態(tài)性分析和DNA指紋識別技術(shù)進一步證實了該細胞系具有純合性。所以,在IVF/ICSI治療過程中被丟棄的孤雌激活來源的1PN胚胎,可作為純合的人類胚胎干細胞的來源,為獲得純合的人類胚胎干細胞提供了一種新方法。此后,相繼有研究[31-32]得到類似的結(jié)果。

        三、展望

        1PN胚胎染色體異常的可能性較大,即使是含有Y染色體的1PN胚胎,也只能說明卵母細胞受精,不能排除1PN胚胎是非整倍體的可能。非整倍體的1PN胚胎基本不具備種植潛能,即便是成功著床,也會在孕早期發(fā)生自然流產(chǎn),很少有非整倍體的胚胎活產(chǎn),故臨床工作中常規(guī)將此類胚胎丟棄。

        近些年來興起的time-lapse技術(shù)可以在封閉環(huán)境下動態(tài)地觀察胚胎發(fā)育情況,鑒別出那些因錯過了最佳的觀察時機、雌雄原核不同步及雌雄原核融合等導致的1PN胚胎,但因其價格昂貴且不能有效地改善妊娠結(jié)局、提高輔助生殖技術(shù)的安全性[33],尚未在各個生殖中心廣泛采用。囊胚培養(yǎng)可篩選出部分染色體組成相對正常的1PN胚胎。鑒于囊胚培養(yǎng)目前已可以作為一項常規(guī)技術(shù)在許多生殖醫(yī)學中心開展,臨床上可通過對1PN胚胎行囊胚培養(yǎng)來淘汰部分異常胚胎,選擇優(yōu)質(zhì)囊胚作為移植的備選選項,但必須充分告知患者可能的風險,并嚴格地進行隨訪,要求患者常規(guī)進行產(chǎn)前檢查,以及早發(fā)現(xiàn)異常胎兒。

        胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)技術(shù)是以提高妊娠率、活產(chǎn)率為目的的早期產(chǎn)前診斷方法,作為選擇胚胎的一種方式,在臨床上已得到了越來越廣泛的應(yīng)用[34]。隨著技術(shù)的不斷革新與進步,新的更為全面、準確的基因篩查技術(shù)也層出不窮,CCS(Comprehensive Chromosome Screening)技術(shù)又名比較基因組雜交-胚胎植入前基因篩查技術(shù),是一種基于DNA的基因篩查技術(shù),可以篩查全部的染色體或是部分非整數(shù)倍染色體,在不損害胚胎的情況下就能檢測出全部的基因遺傳學問題,確保植入子宮內(nèi)的胚胎是完全正常的[35]。胚胎種植前基因診斷(PGD)/PGS/CCS測序技術(shù)日益成熟,若將其用于無可利用胚胎的患者,對1PN胚胎進行篩查,挑選正??梢浦驳?PN胚胎,將改善這類患者的妊娠結(jié)局。

        綜上所述,對于臨床助孕治療中無可利用胚胎或可利用胚胎數(shù)目不足的患者,移植IVF-1PN胚胎不失為一個選擇。因1PN胚胎的形成機制尚不明確,尚需要大量的實驗和研究,從根本原因出發(fā),避免1PN胚胎的產(chǎn)生,提高患者卵母細胞利用率。進一步結(jié)合time-lapse觀察結(jié)果、囊胚培養(yǎng)及PGD/PGS/CCS等新型的篩選優(yōu)質(zhì)胚胎的方法來選擇正常胚胎進行移植,并隨訪患者的妊娠結(jié)局。

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        [編輯:谷炤]

        Research advance in embryos derived from monopronucleated zygotes in IVF/ICSI cycles

        ZHANG Ya-nan,YIN Bao-li,ZHANG Cui-lian*,JIANG Li-le,WEI Duo,XIE Juan-ke

        Medical Reproduction Center,People’s Hospital of Zhengzhou University/Henan Provincial People's Hospital,Zhengzhou450003

        【Abstract】In the procedure of human assisted reproduction,embryos derived from monopronucleated zygotes which assume a definite proportion of the numerous morphological normalities. These oocytes could develop into aneuploidy to a scale and affect the embryonic development and pregnancy outcomes consecutively. Whether the embryos derived from monopronucleated zygotes could be transfered in the process of assisted reproduction has not been determined. The review is focused on the discoveries about the single pronucleated zygotes overall the world during the past decades and found that a group of factors have an association with its formation mechanism. The majority of the studies suggested that embryos developed from 1PN zygotes should be discarded for any reproductive purpose as their chromosome constitution are more likely abnormal. Both domestic and foreign researchers,however,have confirmed that the monopronucleated zygotes may fertilize normally,especially IVF-1PN,and develop into a healthy baby. According to this point of view,transplatation of single pronucleated embryos in IVF cycles may be a good option for the couples who obtained none good quality embryos,after they are given fully informed consent.

        【Key words】Human monopronucleated zygotes;IVF;ICSI;Chromosome;Aneuploid

        DOI:10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.018

        【收稿日期】2015-09-03;【修回日期】2015-10-22

        【基金項目】河南省科技廳重點科技攻關(guān)項目(No.1221023 10536);河南省醫(yī)學科技攻關(guān)計劃重點項目(No.201202022)

        【作者簡介】張亞楠,女,河南漯河人,碩士,生殖醫(yī)學專業(yè).(*通訊作者)

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