王丹，姚曉東，郝曉娟，曹揮，李新鳳，王建明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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枯草芽孢桿菌D-29對(duì)采后梨褐腐病的抑制效果研究

王丹，姚曉東，郝曉娟*，曹揮，李新鳳，王建明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：為探究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)D-29對(duì)采后病害的抑制效果，本研究以梨為試驗(yàn)對(duì)象，以果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena)為病原菌，通過在果實(shí)傷口上接種不同處理的D-29處理液測(cè)定其對(duì)采后梨褐腐病的抑制效果，監(jiān)測(cè)D-29菌體在果實(shí)傷口上數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，D-29菌懸液可有效降低梨褐腐病的發(fā)病率，濃度越大，抑制效果越明顯；先接種D-29菌懸液的處理組，果實(shí)的發(fā)病率明顯低于先接種病原菌孢懸液的處理組，對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制率明顯高于先接種病原菌孢懸液的處理組，且在先接種D-29菌懸液的處理組中，與接種病原菌孢懸液的時(shí)間間隔越長(zhǎng)，抑菌效果越好；D-29+無菌水及D-29+病原菌孢懸液兩種處理下，D-29菌體均能在短時(shí)間內(nèi)在果實(shí)傷口上定殖。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；梨；褐腐病；生物防治

果蔬與人們的生活息息相關(guān)，其采后病害造成的損失逐漸引起了人們的關(guān)注，成為一項(xiàng)亟待解決的問題。目前防治病害侵染的方法有物理防治、化學(xué)防治及生物防治，主要以化學(xué)防治為主[1]。但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期過量使用導(dǎo)致果蔬病原菌抗藥性增強(qiáng)及毒物殘留量的增加，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人畜的健康造成威脅[2,3]?；趯?duì)化學(xué)殺菌劑日益加劇的限制要求，以及20世紀(jì)80年代以來抗病蟲害及農(nóng)作物大田病害生物防治蓬勃發(fā)展的帶動(dòng)下，果蔬采后病害的生物防治受到重視，逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[4～7]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、產(chǎn)生抗逆芽孢、對(duì)人畜無害、對(duì)環(huán)境友好等突出特征的生防細(xì)菌[8]，目前已有多種枯草芽孢桿菌菌劑推向市場(chǎng)[9]。D-29是一株從健康地膚中分離得到的枯草芽孢桿菌，目前已有研究表明其對(duì)多種植物病原真菌具有抑制作用[10,11]。本研究將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)D-29應(yīng)用于采后梨褐腐病的生物防治，以探究該菌株在不同處理下對(duì)褐腐病的抑制效果，以及在果實(shí)傷口的動(dòng)態(tài)變化，以便為商業(yè)化條件下果實(shí)的儲(chǔ)藏提供一定的依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)D-29是從健康地膚上分離的一種內(nèi)生生防細(xì)菌，褐腐病原菌果生鏈核盤菌(Moniliniafructigena)分離于自然發(fā)病的梨。二者均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2培養(yǎng)基

NA、NB、PDA培養(yǎng)基[12]。

1.3D-29處理液及病原菌孢懸液的制備

將活化后的D-29菌株接種于含30 mL NB培養(yǎng)液的錐形瓶中，于30 ℃ 170 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀后用無菌水洗滌，并分別調(diào)濃度至106、107、108CFU·mL-1液備用。

挑取試管保存的褐腐病原菌菌株接種于PDA平板，于25 ℃培養(yǎng)7 d，收集孢子并用無菌水重懸稀釋至105spores·mL-1備用。

1.4果實(shí)的處理

選取大小及成熟度一致的健康梨果實(shí)，采用Ting等[13]的方法進(jìn)行消毒處理。在超凈工作臺(tái)中使用滅菌圓木棒(φ=3 mm)在每個(gè)果實(shí)腰部人工制造一個(gè)大小約3 mm×3 mm的傷口。

第三，改變以往零散經(jīng)營(yíng)、松散合作的簡(jiǎn)單團(tuán)隊(duì)協(xié)作方式，通過股份合作組建大型商業(yè)企業(yè)，運(yùn)行現(xiàn)代企業(yè)管理制度。要把眾多中小閩商或以行業(yè)、或以地域?yàn)閱挝宦?lián)合起來，組建大型商業(yè)企業(yè)或商貿(mào)城，用現(xiàn)代企業(yè)形式實(shí)現(xiàn)互助合作共同經(jīng)營(yíng)，把閩商的團(tuán)隊(duì)協(xié)作納入現(xiàn)代企業(yè)管理，建立股權(quán)分散但經(jīng)營(yíng)權(quán)集中的現(xiàn)代企業(yè)制度，有利于參與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，又避免自相競(jìng)爭(zhēng)。這樣，閩商團(tuán)隊(duì)協(xié)作就上升到現(xiàn)代企業(yè)制度和企業(yè)文化的高度。這需要政府出面協(xié)調(diào)運(yùn)作，從金融服務(wù)、科技中介服務(wù)、投資環(huán)境服務(wù)、公共服務(wù)等多方面入手，整合閩商力量。

1.5拮抗菌D-29最適拮抗?jié)舛鹊臏y(cè)定

分別在果實(shí)傷口處加20 μL濃度為106、107、108CFU·mL-1的D-29菌懸液，以等量無菌水為對(duì)照(CK)，待液體晾干后再分別滴加20 μL濃度為105spores·mL-1病原菌孢懸液。對(duì)處理完成后的果實(shí)做好保濕措施，并于25 ℃下恒溫儲(chǔ)藏，4 d后觀察記錄果實(shí)的發(fā)病情況，并采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。每處理6個(gè)果實(shí)，各做3次重復(fù)，該試驗(yàn)重復(fù)兩次。

果實(shí)發(fā)病率/%=每組果實(shí)發(fā)病的數(shù)量/該組果實(shí)的總數(shù)×100。

病斑擴(kuò)展抑制率/%=(對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑)/對(duì)照病斑直徑×100。

1.6接種時(shí)間對(duì)拮抗菌D-29抑菌效果的影響

該試驗(yàn)分兩組，一組為先接種20 μL濃度為108CFU·mL-1的D-29菌懸液于果實(shí)傷口，分別經(jīng)2、12、24 h后再接種20 μL濃度為的105spores·mL-1病原菌孢懸液；另一組為先在果實(shí)傷口上接種20 μL 105spores·mL-1病原菌孢懸液，分別經(jīng)2、12、24 h后再接種20 μL濃度為108CFU·mL-1的D-29菌懸液。以無菌水為對(duì)照。儲(chǔ)藏方法及觀測(cè)依據(jù)同1.5。每處理6個(gè)果實(shí)，各做3次重復(fù)，該試驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.7拮抗菌D-29在果實(shí)上傷口處的動(dòng)態(tài)變化測(cè)定

處理一為20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌懸液+20 μL無菌水，處理二為20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌懸液+20 μL 105spores·mL-1病原菌孢懸液。兩種液體滴加的時(shí)間間隔為2 h。儲(chǔ)藏方法同1.5。分別于0、12、24、36、48、72和96 h時(shí)隨機(jī)取樣測(cè)定菌體數(shù)量。測(cè)定方法參照Wojciech[14]等的方法。每次隨機(jī)抽取5個(gè)果實(shí)，該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(P=0.05)，采用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1D-29不同濃度對(duì)梨褐腐病的抑制效果

由表1可知，和無菌水對(duì)照組相比，隨著D-29濃度的增加，梨褐腐病的發(fā)病率降低，病斑擴(kuò)展抑制率升高。當(dāng)濃度為106CFU·mL-1和107CFU·mL-1時(shí)，果實(shí)發(fā)病率分別為53.9%、34.9%，病斑擴(kuò)展抑制率分別為65.2%、76.6%；當(dāng)濃度為108CFU·mL-1時(shí)，果實(shí)發(fā)病率最低，僅為4.55%，病斑擴(kuò)展抑制率高達(dá)98.6%。由此可見，108CFU·mL-1D-29菌懸液的抑菌效果最佳。

2.2D-29不同接種時(shí)間對(duì)梨褐腐病的抑制效果

在接種病原菌孢懸液前2 h和12 h分別接種D-29菌懸液，果實(shí)發(fā)病率分別為4.8%、4.7%，病斑擴(kuò)展抑制率分別為97.9%、98.9%，這兩個(gè)時(shí)間間隔處理下的果實(shí)發(fā)病率和病斑擴(kuò)展情況之間均無明顯差異(P<0.05)。但與對(duì)照組相比，果實(shí)發(fā)病率明顯降低，且能效控制病斑的擴(kuò)展；前24 h接種D-29菌懸液，可完全控制病害的發(fā)生。在接種病原菌孢懸液后2、12和24 h分別接種D-29菌懸液，果實(shí)發(fā)病率分別為35.7%、64.3%、79.4%，病斑擴(kuò)展抑制率分別為88.7%、78.9%、42.7%。整體來看，在相同的時(shí)間間隔下，先接種D-29菌懸液的處理組，果實(shí)發(fā)病率明顯低于先接種病原菌孢懸液的處理組，對(duì)病斑擴(kuò)展的抑制率明顯高于先接種病原菌孢懸液的處理組(P<0.05)(表2)。

表1不同濃度的D-29菌懸液對(duì)梨褐腐病的抑制效果

Table 1Inhibitory efficacy of different concentration of D-29 on brown rot of pears

D-29菌懸液濃度ConcentrationofBacillussubtilisD-29發(fā)病率/%Diseaserate病斑擴(kuò)展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-1×106CFU·mL-153.9±11.1b65.2±9.1b1×107CFU·mL-134.9±4.2b76.6±3.5b1×108CFU·mL-14.55±4.7c98.6±3.9a

表2拮抗菌D-29不同接種時(shí)間對(duì)梨褐腐病的抑制效果

Table 2Inhibitory efficacy of different inoculation time of D-29 on brown rot of pears

不同的接種時(shí)間間隔IntervaltimeofinoculationofD-29andpathogen發(fā)病率/%Diseaserate病斑擴(kuò)展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-D-29先于病原菌2h4.8±0.8de97.9±11.3a12h4.7±0.8de98.9±6.4a24h0e100a病原菌先于D-292h35.7±18.9cd88.7±9.6ab12h64.3±19.3bc78.9±4.8b24h79.4±10.1ab42.7±4.7c

2.3D-29在果實(shí)傷口處的數(shù)量動(dòng)態(tài)結(jié)果

D-29菌體數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。處理一(D-29+無菌水)菌體D-29的數(shù)量在0～12 h內(nèi)迅速上升，12 h時(shí)菌體數(shù)量達(dá)為4.7×107CFU，是0 h的39倍；12～48 h呈緩慢上升趨勢(shì)；之后菌體數(shù)量穩(wěn)定在5.0×108～7.9×108CFU之間。處理二(D-29+病原菌)D-29的數(shù)量在0～12 h內(nèi)受病原菌的影響，數(shù)量呈小幅下降；12～48 h內(nèi)菌體數(shù)量迅速上升，在48 h時(shí)高達(dá)1.04×109CFU；48～72 h呈下降趨勢(shì)；之后趨于平穩(wěn)(5.4×108～6.2×108CFU)。總體來看，兩種處理下的D-29菌體數(shù)量均能在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖，之后趨于平穩(wěn)。

圖1　D-29菌體在梨果實(shí)傷口上數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1　Population dynamics of D-29 in the wound of pear fruit

3結(jié)論與討論

枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)來抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖[15～17]。本研究表明，D-29菌懸液對(duì)采后梨褐腐病有較強(qiáng)的抑制效果，且隨濃度的升高抑菌效果增大，這與趙妍等[18]探究枯草芽孢桿菌B10對(duì)采后草莓病害防治效果結(jié)果一致，F(xiàn)an等[19]的研究也表明，隨枯草芽孢桿菌B-912濃度的增大，采后桃和油桃褐腐病的發(fā)病率及病斑擴(kuò)展越小，這可能與枯草芽孢桿菌能分泌抗菌物質(zhì)有關(guān)，菌體濃度越大，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的濃度也相應(yīng)增大，對(duì)病原菌的殺傷力也增強(qiáng)。

D-29與病原菌接種的先后順序及接種的時(shí)間間隔對(duì)采后梨褐腐病的發(fā)病率及對(duì)病斑擴(kuò)展抑制率也有顯著的影響，先接種D-29菌懸液，抑菌效果明顯好于先接種病原菌孢懸液的處理組，且在先接種D-29菌懸液的處理組中，時(shí)間間隔為24 h時(shí)，可完全抑制病害的發(fā)生，抑菌效果最佳。Lu等[20]的研究表明，在接種病原菌前48～72 h接種拮抗菌，果實(shí)發(fā)病率及病害的嚴(yán)重程度有大幅度的下降。范青等[21]在枯草芽孢桿菌對(duì)采后柑橘青霉及綠霉病的防效試驗(yàn)中表明，接種拮抗菌的48 h后再接種病原菌比24 h后接種的抑菌效果要好。這些研究均表明，越早接種拮抗菌，抑菌效果越佳，這也為實(shí)際商業(yè)化條件下采后果實(shí)的儲(chǔ)藏提供了依據(jù)，越早采取拮抗菌處理措施，越能有效控制病害的發(fā)生及發(fā)展。

D-29菌體在梨果實(shí)傷口上數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化測(cè)定結(jié)果表明，無論病原菌孢懸液的存在與否，D-29菌體均能在短時(shí)間內(nèi)在果實(shí)傷口上定殖。Mercier等[22]認(rèn)為，拮抗菌在果實(shí)傷口的快速繁殖是控制病害的關(guān)鍵因素。拮抗菌迅速繁殖，占據(jù)生存空間，攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于病原菌的生長(zhǎng)繁殖，從而有效控制了病害的發(fā)生。

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(編輯：張貴森)

Inhibitory efficacy of postharvest brown rot in pear fruits byBacillussubtilisD-29

Wang Dan, Yao Xiaodong, Hao Xiaojuan*, Cao Hui, Li Xinfeng, Wang Jianming

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:The aim of the study was to test the inhibitory efficacy of Bacillus subtilis D-29 in control of brown rot disease of pear fruits caused by Monilinia fructigena. The inhibitory efficacy was determined by inoculating with different treatments of D-29 on the wounds of pears, and the population dynamics of D-29 in fruit wound was also determined. Results showed that D-29 could not only effectively reduce the disease rate of pear brown rot but also significantly increase the inhibition rate of disease spot enlargement; and the inhibitory ability was improving with the increasing concentration of cell suspension. The inoculation of D-29 before pathogen, disease incidence decreased obviously and inhibition rate of disease lesion expansion increased significantly. In the treatment that D-29 was inoculated in the fruit wound before pathogen, the interval time of inoculation and inhibitory efficacy had obviously positive correlation. Under the treatments both D-29+sterile water and D-29+pathogen, the population of D-29 could grow and reproduce rapidly in fruit wound.

Key words:Bacillus subtilis; Pear; Brown rot; Biological control

中圖分類號(hào)：S476.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)03-0182-04

基金項(xiàng)目：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中青年學(xué)術(shù)骨干基金(XG201210)；中國博士后基金(個(gè)人編號(hào)：92459)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311007-3)；2014年度山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目子項(xiàng)目(FT201402-12)；山西省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2015091004-0104)

作者簡(jiǎn)介：王丹(1988-)，女(漢)，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向：生物農(nóng)藥與生物防治*通訊作者：郝曉娟，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel:0354-6288344; E-mail:xiaojuanhao@126.com

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-26