竇冰然，郭會明，朱曼利，李偉，洪厚勝,3*

1(南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院，江蘇 南京，211816) 2(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211816) 3(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京，210009)

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固定化酵母在釀造技術及燃料乙醇領域中的應用

竇冰然1，郭會明1，朱曼利1，李偉2，洪厚勝2,3*

1(南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院，江蘇 南京，211816) 2(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211816) 3(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京，210009)

細胞固定化技術從20世紀70 年代開始快速發(fā)展，現(xiàn)已在在發(fā)酵工業(yè)、生物能源、化學分析、醫(yī)藥工業(yè)等多個領域得到了廣泛的運用，充分顯示了這種技術的優(yōu)越性。同時，固定化細胞生長速度快、反應快、不易染菌、節(jié)約成本、產(chǎn)物易于分離，越來越多的應用于發(fā)酵領域中。憑借以上優(yōu)點，固定化酵母也被越來越多的研究者深度研究，不同的固定化方法和固定化載體對酵母固定化的效果有很大影響。文章綜述了傳統(tǒng)的酵母固定化方法和新型固定化方法，并介紹了固定化酵母在釀造技術和燃料乙醇領域的應用概況，展望了固定化酵母的應用前景和研究方向。

固定化技術；酵母；燃料乙醇；固定化反應器

固定化技術運用在細胞方面多用于在酶和酵母，酵母早已在發(fā)酵行業(yè)擁有廣泛的應用基礎，隨著固定化技術的不斷推廣，固定化酵母開始替代游離酵母在酒精發(fā)酵方面使用，主要分為釀酒技術和燃料乙醇兩個應用方面。雖然，酵母固定化技術也存在著傳質(zhì)限制、固定介質(zhì)抑制固定化酵母生長和其代謝等缺陷的問題，但是站在長遠發(fā)展的角度來看，應用酵母固定化技術在發(fā)酵行業(yè)依然發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

1 固定化酵母概述

1.1 細胞固定化技術

細胞固定化技術是在20世紀70年代發(fā)展起來的一門新興技術，是指用物理或者化學的方法將具有一定生理活性的生物細胞，如動植物細胞、微生物細胞等固定于載體上，用作固體生物催化劑，并使其在連續(xù)反應時中能夠保持穩(wěn)定生長并且繁殖能力維持旺盛，并且可以反復使用的一種固定化方法[1]。固定化技術首先應用于各種固定化酶，隨后應用于固定化完整細胞。

相比于游離態(tài)細胞，細胞因為受到載體的固定化，有利于固定后的細胞與產(chǎn)物之間的分離，而且研究發(fā)現(xiàn)，固定化之后的細胞，其反應速率得到了顯著提高。因此這項技術在制藥行業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)保行業(yè)與傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)[2]中都得到了廣泛的推廣使用。根據(jù)固定化后的細胞是否增殖還可以分為靜止細胞、饑餓細胞和增殖細胞等固定化技術，其中，固定化增殖細胞因為固定化后的細胞可以不斷繁殖更新且更加穩(wěn)定的特點，在發(fā)酵工業(yè)中最有發(fā)展前途。

1.2 固定化酵母的優(yōu)越性

固定化酵母指將酵母活細胞高度密集分布在載體上，并可以不斷地增殖，以此得到高濃度生物催化劑。使用固定化的酵母進行發(fā)酵與使用傳統(tǒng)的游離態(tài)酵母進行發(fā)酵方法相比具備以下3個優(yōu)點：

(1)酵母經(jīng)固定化后細胞的密度得到提高，增殖速度更快，縮短了發(fā)酵周期，同時穩(wěn)定性較高；

(2)固定化酵母可以重復利用，使用壽命可達兩個月，相比于游離酵母，培養(yǎng)過程也更加簡單,同時減少了營養(yǎng)基質(zhì)的流失，有利于連續(xù)生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本；

(3)設備要求簡單，易于操作，投資費用低，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

2 細胞固定化方法

2.1 包埋法

包埋法是指在無菌的條件下，將細胞與凝膠溶液相混合，再經(jīng)過一定處理，通過物理方法形成直徑1～4 mm的膠粒，使酵母固定化。利用這種方法得到的固定化酵母和載體之間沒有束縛，經(jīng)過固定化之后，細胞依然可以保持較高活力[3]，可以在短時間之內(nèi)提高反應速率和細胞濃度，且操作簡便，反應條件溫和，對于細胞的活性影響較小，所以是固定化酵母的常用手段。常規(guī)的凝膠載體包括海藻酸鈉、聚乙烯醇(PVA)、卡拉膠、聚丙烯酞胺(ACAM)、瓊脂、醋酸纖維等[4]。近年來，也有將不同凝膠載體組合使用制成復合固定化載體進行固定、發(fā)酵的實驗方法。周寧等[5]用海藻酸鈉-瓊脂作為固定化載體，固定化啤酒酵母，通過優(yōu)化載體固定化條件和固定化啤酒酵母的發(fā)酵條件，發(fā)酵速度提高為0.735 °p/h，且復合固定化載體相比于單一的海藻酸鈉載體或者瓊脂載體更適合酵母增殖。高亞飛等[6]通過將一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉溶液混合作為固定化載體，包埋糖蜜酒精酵母，通過正交優(yōu)化確定以聚乙烯醇-海藻酸鈣為固定化載體的糖蜜酒精酵母的最優(yōu)發(fā)酵條件，優(yōu)化后的酒精濃度為13.11%vol。巫小丹等[7]通過實驗對比了SA-PVA-SiO2載體固定化釀酒酵母與游離釀酒酵母的乙醇發(fā)酵能力，并通過電鏡掃描對固定化釀酒酵母的包埋微生態(tài)環(huán)境進行分析，結果顯示固定化小球的內(nèi)部條件十分有利于酵母細胞生產(chǎn)乙醇所需要的厭氧發(fā)酵，從而充分證明了 以SA-PVA-SiO2為載體的固定化釀酒酵母對于乙醇發(fā)酵的優(yōu)越性。

2.2 吸附法

吸附法也可以叫做載體結合法，這種方法具有經(jīng)濟且制備方法簡單的特點。吸附法的原理是通過靜電吸引作用或者利用載體對酵母細胞的親和性將酵母細胞吸附在固體載體上的一種固定化方式。此方法的優(yōu)點在于細胞和載體之間發(fā)生的是物理變化，而且操作簡單、活性損失小、固定化載體可以反復使用、固定化條件溫和，但是由于制得的固定化酵母吸附能力不強，容易造成細胞脫落，所以受環(huán)境影響大，穩(wěn)定性差[8]。對于吸附法固定酵母細胞，通常選用內(nèi)部多孔、表面積大、性質(zhì)比較穩(wěn)定、價格低廉、高強度、性質(zhì)性能良好的材料作為載體。常用的載體包括活性炭、硅藻土、碳酸鈣、高嶺土、石英砂、陶瓷、木屑、硅膠、多孔玻璃等[9]。

當使用單一的包埋法或吸附法對酵母細胞進行固定化時，發(fā)酵產(chǎn)生的結果也會有所不同。朱元華[10]以山毛櫸木片和海藻酸鈉固定化酵母，利用氣相色譜法對比兩種固定化方法對啤酒風味物質(zhì)成分的影響，結果表明，當選用不同的固定化載體時，對啤酒中風味物質(zhì)成分的形成也有所不同，其中海藻酸鈉載體固定化酵母的牢固程度最好，且啤酒中醇類物質(zhì)含量較高，適于醇厚型啤酒的釀造；利用山毛櫸木載體固定化的酵母細胞釀造的啤酒生成的酯類物質(zhì)較多，適于淡爽型啤酒發(fā)酵。近年來，也有研究人員將不同的固定化方法結合使用的報道，陶中書等[11]利用海藻酸鈉和山毛櫸木片來吸附-包埋復合固定化酵母用于啤酒連續(xù)發(fā)酵，通過對比試驗發(fā)現(xiàn)，復合固定化酵母數(shù)量最多，生物載荷量高達2.17×1010個/g，并且牢固程度也最優(yōu)。

2.3 交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用雙功能或者多功能試劑和細胞表面的反應基團反應，使細胞固定，交聯(lián)法的不需要載體，可以得到較高的細胞濃度，并且結合力高，穩(wěn)定性較好，經(jīng)得起溫度、pH的劇烈變化，但是由于反應激烈，對細胞的活性會產(chǎn)生影響，所選試劑會毒害活細胞，機械強度低，無法再生，因而實際生產(chǎn)應用不多，通常與其他固定化方法結合使用[12]。常用的試劑有甲苯二異氰酸酯、戊二醛、雙偶氮聯(lián)苯等。此方法多用于固定化酶的研究，用于酵母的固定化則報道不多。

2.4 絮凝法

絮凝法是利用自身具有的自絮凝能力的某些微生物細胞對細胞進行固定化的方式，是一種不需要添加固定化載體的細胞固定化方法。VERSTREPEN[13]等認為絮凝機制分可分為2種:一種是細胞表面的凝集素和鄰近細胞的細胞表面甘露糖結合引起的絮凝；另一種是細胞表面的多肽相互吸引或細胞表面疏水相互作用力的相互作用而引起的絮凝。絮凝法的優(yōu)點在于固定化過程簡單、細胞代謝能力高、代謝抑制和傳質(zhì)限制小、細胞可以長期使用等優(yōu)點。但是由于細胞顆粒剛性比較差，所以存在容易發(fā)生變形，不耐剪切，對發(fā)酵所需原料要求高等缺點。對于某些不可絮凝或者絮凝能力較弱的酵母菌,有時可通過外源添加助凝劑或交聯(lián)劑的方法來促進絮凝,此法即為交聯(lián)法。白鳳武[14]以酵母自身絮凝形成顆粒固定化細胞，建立了有效容積0.5 m3的懸浮床生物反應器用于酒精連續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵過程順利完成。

2.5 膜隔離法

膜隔離法的作用機理是利用半透膜將細胞限制在一定的空間內(nèi)，底物和產(chǎn)物可以通過半透膜，但是微生物細胞則不能通過，從而達到細胞固定化的目的的一種方法，常用的半透膜包括超濾膜、反滲透膜、滲析膜、中空纖維膜等[15]。膜隔離法的特點是可以通過控制膜孔徑選擇性的控制底物與產(chǎn)物的擴散、基質(zhì)可以充分接觸微生物細胞，缺點是傳質(zhì)受到限制、膜容易發(fā)生堵塞、成本也相對較高[16]。

2.6 新型固定化方法

相比于以上傳統(tǒng)固定化方法，近年來出現(xiàn)了許多新型固定化方法。李貴銀[17]研究了利用制備的磁性納米殼聚糖微球作為載體對酵母細胞進行固定化，實驗發(fā)現(xiàn)在催化反應時，磁性固定化細胞的活性優(yōu)于游離細胞,并且有一定的儲存穩(wěn)定性。周勖[18]利用納米氧化鋅固定化釀酒酵母，結果表明在催化反應中使用含有1×10-2g/mL及以上濃度的納米氧化鋅固定細胞,能夠使反應液及分離后的反應上清液具有針對原核生物較好的抗菌能力。董江清[19]利用新鮮甘蔗去皮后切成的約1 cm3的甘蔗塊固定化酵母細胞，研究發(fā)現(xiàn)使用這種新型固定化材料固定化的酵母與游離酵母發(fā)酵相比更具有優(yōu)越性，酵母經(jīng)過固定化后發(fā)酵36 h時與發(fā)酵相同時間的游離酵母相比發(fā)酵速率更高。

3 酵母固定化在釀造技術中的應用

固定化酵母能夠提高酵母對于抑制發(fā)酵性產(chǎn)物和發(fā)酵環(huán)境的耐受力。由于酵母細胞固定后載體表面和載體內(nèi)酵母細胞濃度得到提高,形成了濃度優(yōu)勢,從而確保酵母不易染菌,同時有效的減少了有害物質(zhì)對酵母產(chǎn)生的抑制作用。

固定化酵母用于釀酒技術相比于游離酵母，可以有效改善風味，使口感更加柔和，同時由于固定化酵母發(fā)酵過程中可以有效減少菌體損失，可以用于酒精連續(xù)發(fā)酵中，發(fā)酵效率有效提高。薄艷秋等[20]將加有 SiO2和 Al2O3的 PVA-海藻酸鈉載體進行強化，用于固定藍莓酵母，強化后固定化酵母發(fā)酵的藍莓酒香味濃郁、持久，口味柔滑，相比之下游離酵母發(fā)酵的藍莓酒酒體單薄，因酸度太高，苦澀感較重。潘嫣麗等[21]在加入0.01%的以海藻酸鈉作為載體固定化酵母，在25 ℃條件下發(fā)酵8 d，得到了酒精含量在12.8%vol的雪蓮果-西番蓮復合果酒，該產(chǎn)品色澤淡黃自然、具體和諧的果香和酒香、入口清爽。劉凱[22]利用固定化酵母進行啤酒的連續(xù)發(fā)酵，生產(chǎn)出的啤酒的主要理化指標與傳統(tǒng)間歇式發(fā)酵所生產(chǎn)出的啤酒接近，對成品啤酒的品質(zhì)與風味沒有產(chǎn)生不良影響。

4 酵母固定化在制備燃料乙醇中的應用

隨著能源危機和環(huán)境污染等問題日益嚴重,許多國家開始積極研發(fā)石油替代資源。燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源,因而得到了各方廣泛關注。然而,菌體抗脅迫能力差、底物轉化率低以及生產(chǎn)成本高等問題制約了燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,實驗人員圍繞這些問題開展了大量的研究。眾多學者將酵母細胞固定化技術應用于燃料乙醇的研究與制備中[23-24],并取得了良好的效果。

固定化酵母發(fā)酵對酵母細胞生理特性和代謝活力等方面會產(chǎn)生影響,如細胞的形態(tài)、胞內(nèi)的滲透壓、pH和細胞膜的通透性[25]等,導致酵母細胞中原本的生理生化平衡環(huán)境被破壞, 并導致胞內(nèi)關鍵酶活性產(chǎn)生波動, 出現(xiàn)相容性溶質(zhì)和細胞周期發(fā)生變化等。GLAZZO等[26]發(fā)現(xiàn)相比于游離酵母，固定化酵母的乙醇生成速率更快, 且前者胞內(nèi)的磷酸果糖激酶與ATPase活性高于前者。DORAN等[27]發(fā)現(xiàn)固定化酵母的胞內(nèi)儲存性多糖含量更高,同時,胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的種類和含量同樣存在著明顯差別。

目前,在燃料乙醇的研究與制備中, 連續(xù)發(fā)酵已經(jīng)逐步取代了分批發(fā)酵工藝,而酵母細胞固定化技術可以明顯提升連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的效果,所以在連續(xù)發(fā)酵的同時加入酵母細胞固定化技術進行燃料乙醇的生產(chǎn)一貫是該領域的研究熱點之一。固定化酵母在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)上已經(jīng)得到了廣泛的應用。李文[28]利用海藻酸鈉包埋酵母以小麥秸稈作為發(fā)酵底物生產(chǎn)燃料乙醇，發(fā)酵120 h后，乙醇濃度達28.94 g/L,乙醇產(chǎn)率為76%，并且對固定化酵母進行了循環(huán)利用。王治業(yè)等[29]利用固定化酵母直接發(fā)酵甜菜汁制備燃料乙醇，固定化酵母進行甜菜酒精發(fā)酵比游離酵母酒精平均值提高了2.86%。在發(fā)酵過程中不進行滅菌處理的情況下連續(xù)發(fā)酵9個批次，產(chǎn)酒精性保持穩(wěn)定。鄔全喜[30]利用以海藻酸鈉為載體的固定化酵母生產(chǎn)櫻桃果酒，研究游離態(tài)酵母后期發(fā)酵速度減慢，而且會產(chǎn)生底物抑制，固定化酵母最終酒精度更高，并且菌體回收方便，在工業(yè)化生產(chǎn)上具有突出的優(yōu)勢。

5 固定化反應器

生物反應器的選擇與設計是利用固定化酵母連續(xù)生產(chǎn)燃料乙醇的關鍵之一。目前,得到廣泛應用的生物反應器主要分為五類[31]:流化床反應器，氣升式反應器，填充床反應器，膜式反應器和攪拌反應器。

5.1 氣升式反應器

使用氣升式反應器固定化細胞的生長速率較高，混合度相對較好，而且對細胞存在良好的剪切保護，不易染菌，反應器結構簡單，能耗低。缺點在于不利于生產(chǎn)放大,費用偏高[32]。

5.2 流化床反應器

流化床反應器的優(yōu)點在于方便連續(xù)操作，剪切力小，傳質(zhì)傳熱效果好并且染菌風險低[33]。但是,這種反應器需要固定化介質(zhì)的密度和發(fā)酵液的密度相近,否則會產(chǎn)生能耗增加、發(fā)酵周期發(fā)生改變、固定化酵母分布不均勻甚至洗出等一系列問題。

5.3 填充床反應器

填充床反應器的特點是返混小，結構簡單并且載體機械磨損小等。此類反應器的缺點是操作過程中固體催化劑不能更換，易形成氣溝或風溝以及傳質(zhì)，傳熱效果較差等。此外,用于填充床反應器的固定化介質(zhì)應當具有良好的不可壓縮性。

5.4 膜式反應器

膜式反應器催化效率高,易于放大并且有利于對反應過程的控制,下游相應的處理簡單。然而在發(fā)酵時，產(chǎn)生的濃差極化以及膜污染等問題會導致膜式反應器的傳質(zhì)速率與生產(chǎn)能力迅速降低，膜孔發(fā)生堵塞、膜厚的增加使膜的結構和形態(tài)產(chǎn)生不利變化[34]，因為這些原因所以反應器所使用的膜要求頻繁清洗與更換。

5.5 攪拌反應器

攪拌反應器配備有攪拌裝置,有良好的傳質(zhì)、傳熱性能。但是攪拌產(chǎn)生的剪切力較大,所以要求固定化介質(zhì)具有一定的機械強度,否則會造成固定化介質(zhì)機械磨損,并導致酵母細胞外泄。

6 結語

利用固定化酵母進行發(fā)酵，相比于傳統(tǒng)游離酵母具有更加顯著的優(yōu)點，同時也可以提高發(fā)酵速率，未來固定化酵母的研究方向?qū)⒅饕旁谘芯啃滦凸潭ɑd體，利用納米技術，磁性聚合物微球等將原有固定化方法進行改進，開發(fā)廉價，更利于反復使用，對酵母或細胞毒相對性小的固定化載體。隨著生物技術在國民經(jīng)濟中的地位不斷提高，以及固定化技術的不斷發(fā)展完善和成熟，固定化酵母必然會在發(fā)酵領域及其他相關領域發(fā)揮越來越重要的作用。

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The application of immobilized yeast in brewing technology and in fuel ethanol

DOU Bing-ran1,GUO Hui-ming1,ZHU Man-li1,LI Wei2,HONG Hou-sheng2,3*

1(Nanjing Tech University, College of Chemistry and molecular Engineering, Nanjing 211816,China) 2(Nanjing University of Technology, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing 211816,China) 3(Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co., Ltd.,Nanjing 210009,China)

Immobilized cell technology is a biological technology developed rapidly after the 1970s and now widely used in many fields, including fermentation industry, food industry, chemical analysis and pharmaceutical industry, fully displaying its superiority. Due to the properties of fast growth, quick reaction, anti-pollution ability , cost effective, and convenience for separation, immobilized cells are more and more applied in the field of food and fermentation. With the above advantages, the immobilized yeast was also studied by more and more researchers. Different immobilization methods and immobilized carrier had great influence on the effect of immobilized yeast. The traditional yeast immobilization methods and new immobilization methods were reviewed in this paper. The application situation of immobilized yeast in brewing technology and the field of fuel ethanol were introduced. The application prospect and the research direction of the immobilized yeast were also forecasted in this paper.

immobilization; yeast; ethanol; immobilized bioreactor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610036

碩士研究生(洪厚勝教授為通訊作者,E-mail:hhs@njtech.edu.cn)。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)- 生物過程關鍵技術及裝備開發(fā) (No. 2012AA021201)

2016-04-12，改回日期：2016-05-19