戴 冰， 吳沁璇， 肖子曾*， 曾呈茜，曹璐婷， 歐陽林旗， 楊夢琳

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

?

六味地黃湯及其水提醇溶部位對2型糖尿病模型大鼠脂肪組織中PI3K/Akt信號通路的影響

戴 冰1， 吳沁璇2， 肖子曾2*， 曾呈茜2，曹璐婷2， 歐陽林旗1， 楊夢琳2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

摘要:目的 觀察六味地黃湯及其水提醇溶部位對2型糖尿?。═2DM）模型大鼠脂肪組織中PI3K/Akt信號通路的影響。方法 采用高糖、高脂飼料喂養(yǎng)4周后，再行腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）且空腹血糖（FBG）≥16.7 mmo1/L的大鼠建立2型糖尿病動物模型，將其隨機分為空白組、模型組、羅格列酮組、六味地黃湯組和六味地黃湯水提醇溶部位組，模型組和空白組給予等量蒸餾水，給藥30 d后，測各組大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法測定各組大鼠脂肪組織胰島素受體底物（Irs2）、磷脂酰肌醇3磷酸激酶（Pi3k）、蛋白激酶B（Akt）mRNA的表達情況。結(jié)果 六味地黃湯及其水提醇溶部位均能降低2型糖尿病大鼠FBG值及FINS水平，增強了T2DM大鼠脂肪組織Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表達（P＜0.05）。結(jié)論六味地黃湯可能通過調(diào)節(jié)T2DM大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路來干預(yù)2型糖尿病胰島素抵抗，其水提醇溶部位為該方調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的藥效物質(zhì)之一。

關(guān)鍵詞:六味地黃湯；水提醇溶部位；2型糖尿?。籔I3K/Akt信號通路

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.043

網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-02-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址: httP://www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150206.1144.001.htm1

2型糖尿?。═2DM）是一種多基因遺傳因素、環(huán)境因素綜合作用引起的內(nèi)分泌代謝性疾病。其病理生理的兩個中心環(huán)節(jié)是胰島β細胞功能紊亂和胰島素抵抗（insu1in resistance，IR）［1］，而胰島素信號通路:磷脂酰肌醇3磷酸激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在T2DM的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，與IR及β細胞功能障礙密切相關(guān)［2］。前段研究表明六味地黃湯及其水提醇溶部位均可降低T2DM大鼠血糖、胰島素含有量，改善其IR［3］，其水提醇溶部位是該方水煎液經(jīng)70％乙醇醇沉處理得到，主要含有苷類成分［4］:芍藥苷［5］、馬錢苷［6］、莫諾苷［7］等，是其干預(yù)2型糖尿病IR的藥效物質(zhì)之一。但該方是否通過PI3K/Akt信號通路來改善IR，從而干預(yù)了T2DM尚不知，且其藥效物質(zhì)是否與水提醇溶部位有關(guān)也尚未知。因此研究六味地黃湯及其水提醇溶部位對PI3K/Akt信號通路的影響對于預(yù)防T2DM的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。

1材料與方法

1.1 實驗藥物 六味地黃湯（熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9，茯苓9 g），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供；羅格列酮鈉片（太極集團重慶涪陵制藥有限公司，批號10090198）。

1.2 動物 80只SD雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號: SCXK（湘）2011-0003。

1.3 試劑 枸櫞酸（批號100823），磷酸氫二鈉（批號101125，購自臺山市化工廠有限公司），鏈脲佐菌素（STZ，批號329A021，購自Sigma公司），水合氯醛（批號20100430，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（Rat INS ELISA Kit，Cat.#: CK-E 30620R，美國R&D公司），熒光定量PCR試劑盒、組織蛋白裂解液、引物和內(nèi)參GAPDH均購自長沙賽晶生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 穩(wěn)豪倍易型（ONETOUCH?U1traEasyTM）血糖儀及配套血糖試紙（批號3288439，強生［中國］醫(yī)療器材有限公司）；TD4-Ⅱ型臺式自動平衡離心機（長沙平凡儀表有限公司）；MK3型酶標分析儀（美國Thermo公司）；7900HT型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.5 方法

1.5.1 藥物及制備［8］稱取六味地黃方10付，浸泡30 min，煎煮2次，30 min/次，合并2次濾液并水浴濃縮，得最終質(zhì)量濃度為1.915 g（生藥）/mL的濃縮液。取適量濃縮后的六味地黃湯，70％乙醇醇沉處理，靜置24 h后真空抽濾，醇溶上清液水浴濃縮，水提醇溶部位最終質(zhì)量濃度為11.326 g（生藥）/mL。

1.5.2 高糖高脂飼料配方［9］普通飼料70％、豬油10％、蔗糖15％、牛膽酸鈉0.5％、膽固醇2.5％、食鹽2％交由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物部加工。

1.5.3 2型糖尿病IR大鼠模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白組和造模組，分別給予普通飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，所有動物禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射STZ 45 mg/（kg·d），空白對照組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液，STZ注射72 h（提前10 h禁食不禁水）后斷尾取血檢測大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），視FBG≥16.7 mmo1/L［10］為造模成功。

1.5.4 分組給藥 2型糖尿病IR大鼠模型隨機分為模型組、羅格列酮組0.81 mg/（kg·d）、六味地黃湯組6.75 g生藥/（kg·d）、六味地黃湯水提醇溶部位組6.75 g生藥/ （kg·d）），每組14只，連續(xù)灌胃給藥30 d，空白對照組和模型對照組灌服等體積蒸餾水，給藥劑量按照60 kg成人與200 g大鼠體表面積折算。

1.5.5 標本采集及檢測 大鼠禁食10 h，檢測FBG，按0.35 g/kg計算腹腔注射10％水合氯醛麻醉，解剖，腹主動脈取血，靜置1 h后分離血清-20℃凍存待檢，取腹部脂肪組織，凍存于液氮中，隨即置于-80℃冰箱中待檢Irs2、Pi3k、Akt mRNA。采用酶聯(lián)免疫ELLSA法檢測大鼠血清胰島素（FINS）水平。

1.5.6 熒光定量PCR方法檢測T2DM模型大鼠脂肪組織Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表達 每組取6只大鼠的脂肪組織標本進行mRNA的檢測，采用Trizo1法抽提大鼠脂肪組織總RNA，RT-PCR反應(yīng)依據(jù)Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明進行。PCR反應(yīng)擴增Irs2、Pi3k、Akt所用引物如表1所示。20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中加入RNA 1 μg。核酸蛋白分析儀測定RNA量和純度。其中磷酸甘油醛脫氫酶（GaPdh）為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)采用SYBR?Premix Ex Taq（Takara）試劑，在ABI7900HT熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件（APP1ied Biosystems公司）分析PCR過程各檢測樣本的Ct（thresho1d cyc1e）值，相對表達量用2△△Ct進行計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用單因素方差分析。

表1　胰島素信號引物序列

2 結(jié)果

2.1 六味地黃湯及其水提醇溶部位對T2DM模型大鼠FBG、FINS的影響 給藥1個月后，模型組大鼠與空白組比較，F(xiàn)BG≥16.7 mmo1/L，且FBG、FINS值有顯著性差異（P＜0.01），提示T2DM大鼠模型穩(wěn)定胰島素敏感性降低，發(fā)生了IR；六味地黃湯組及其水提醇溶部位組與模型組比較，大鼠FBG、FINS值有顯著性差異（P＜0.05），提示六味地黃湯及其水提醇溶部位可以降低2型糖尿病IR大鼠的空腹血糖，改善IR，提高胰島素敏感性，但均不能恢復(fù)到正常水平，與空白組比有顯著性差異（P＜0.01）；羅格列酮組與模型組比較，大鼠FBG、FINS值有顯著性差異（P＜0.05），提示陽性藥物能夠改善T2DM大鼠血糖及IR；六味地黃湯組及其水提醇溶部位組與羅格列酮組無顯著性差異，提示六味地黃湯及其水提醇溶部位與陽性藥物作用相似；六味地黃湯水提醇溶部位組與六味地黃湯組比較，F(xiàn)BG值有顯著性差異（P＜0.05），提示六味地黃湯水提醇溶部位降低T2DM大鼠空腹血糖效果優(yōu)于六味地黃湯。結(jié)果見表2。

表2　給藥后各組大鼠FBG、F I NS值比較（±s）

表2　給藥后各組大鼠FBG、F I NS值比較（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01；與六味地黃湯組比較，◆P＜0.05

組別　　動物數(shù)/只FBG/（mmo1·L-1）FINS/（μIU·mL-1）空白組　6　 5.77±0.15　17.63±1.50模型組　8　 22.00±0.98**　29.80±4.11**羅格列酮組　8　 11.98±0.79**●●　20.57±0.85*●●六味地黃湯組　8　 12.51±1.32**●●　22.37±1.95**●六味地黃湯水提醇溶部位組　6　 10.33±1.25**●●◆18.82±1.66*●●

2.2 RT-PCR法測定各組大鼠脂肪組織Irs2、Pi3k、Akt mRNA的相對表達量 給藥1個月后，模型組大鼠脂肪組織Irs2、Pi3k、Akt mRNA表達較空白組明顯降低（P＜0.01），表明以高脂高糖喂養(yǎng)法復(fù)制T2DM大鼠模型在Irs2、Pi3k、Akt mRNA相對定量表達方面造模成功。給藥各組與模型組比較，脂肪組織Irs2、Akt基因相對表達量極顯著上升（P＜0.01），Pi3k基因表達顯著上升（P＜0.05），表明羅格列酮、六味地黃湯及其水提醇溶部位可以緩解脂肪組織PI3K/Akt信號通路Irs2、Pi3k、Akt mRNA表達下降的趨勢。各給藥組之間相比，各指標的差異均無顯著性（P＞0.05），表明羅格列酮、六味地黃湯及其水提醇溶部位對恢復(fù)T2DM大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路相關(guān)基因的表達作用相似。結(jié)果見表3。

3 討論

目前胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究較深入的PI3K/Akt信號通路與胰島素的組織代謝效應(yīng)高度相關(guān)［11-12］。胰島素與細胞表面胰島素受體結(jié)合，激活酪氨酸蛋白激酶（Protein tyrosine kinase，PTK），導(dǎo)致胰島素受體底物1，2（insu1in recePtor substrate-1，-2，IRS-1，2）酪氨酸殘基磷酸化，被磷酸化的IRS結(jié)合磷脂酰肌醇3-激酶（PhosPhatidy1inosito1 3-kinase，PI3K）P85調(diào)節(jié)亞單位，催化P110而激活PI3K，增強PI3K活性，進一步使蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，Akt）絲氨酸殘基磷酸化［13］。被激活的Akt從質(zhì)膜上釋放出來，轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)、線粒體和細胞核內(nèi)，磷酸化各種底物，從而調(diào)節(jié)糖原合成、糖異生和葡萄糖吸收［14］。上述途徑的任何一個環(huán)節(jié)受損均可導(dǎo)致IR。

表3　各組大鼠脂肪組織I r s 2、Pi 3 k、Ak t mRNA的相對表達量（±s）

表3　各組大鼠脂肪組織I r s 2、Pi 3 k、Ak t mRNA的相對表達量（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別　　動物數(shù)/只　Irs2　Pi3k　Akt空白組　6　0.34±0.13　1.16±0.14　1.26±0.23模型組　6　0.1±0.03**　0.35±0.13**　0.68±0.15**羅格列酮組　6　0.27±0.04●●　0.92±0.16●●　1.13±0.29●●六味地黃湯組　6　0.25±0.09●●　0.84±0.35●　1.07±0.10●●六味地黃湯水提醇溶部位組　6　0.25±0.07●●　1.03±0.59●●　1.10±0.24●●

由于脂肪組織是胰島素作用的重要靶組織［15］，PI3K/ Akt信號通路也存在于脂肪組織中［16］。故本研究采用熒光實時定量PCR技術(shù)，從基因水平檢測六味地黃湯及其水提醇溶部位對T2DM大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路的影響。研究發(fā)現(xiàn)六味地黃湯及其水提醇溶部位均可降低T2DM大鼠血糖、胰島素含有量，改善其IR，增加T2DM模型大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路中Irs2、Pi3k、Akt mRNA的表達；表明六味地黃湯及其水提醇溶部位能夠通過上調(diào)T2DM大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵基因Irs2、Pi3k、Akt的表達，促進脂肪組織胰島素信號傳遞的恢復(fù)，干預(yù)IR，從而改善T2DM。這可能是其改善2型糖尿病IR的重要分子機制，該方水提醇溶部位可能為該方調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路的藥效物質(zhì)之一。然其確切的藥效物質(zhì)成分是否與其含有的苷類成分有關(guān)，以及該方水提非醇溶部位對T2DM大鼠IR是否同樣具有類似的干預(yù)作用，今后尚需進一步研究。

參考文獻:

［1］ 丁少川，張瑞珍，劉成柱.2型糖尿病與胰島素抵抗和代謝綜合征［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（3）: 564.

［2］ 王 笑，王甄真，陳雁木.PI3K/AKT信號通路在維持血糖平衡中的作用［J］.生命科學(xué)，2013，25（2）: 133-139.

［3］ 戴 冰，邢 瑞，肖子曾，等.六味地黃湯及其水提醇沉物對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響［J］.中成藥，2014，36（3）: 179-181.

［4］ 熊善麗，趙一民，欒新慧，等.RP-HPLC測定六味地黃方中苷類成分的含量［J］.中國中藥雜志，2003，28（8）: 735-738.

［5］ 李向陽，屠萬倩.RP-HPLC法測定六味地黃丸中丹皮酚、芍藥苷和烏蘇酸［J］.中成藥，2012，34（2）: 277-282.

［6］ 段 彬，魏玉輝.HPLC法同時測定六味地黃丸中3種成分含量［J］.臨床合理用藥雜志，2012，5（11）: 66-67.

［7］ 戴 冰，肖子曾，劉 磊，等.六味地黃丸入血成分莫諾苷對大鼠前脂肪細胞增殖與分化的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12（11）: 1245-1249.

［8］ 戴 冰，蔣冰倩，肖子曾，等.六味地黃湯及其水提醇沉提取物對2型糖尿病腎陰虛證大鼠環(huán)磷酸腺苷的影響［J］.中國生化藥物雜志，2012，33（5）: 634-636.

［9］ 薄海美，田春雨，李繼安.銀耳多糖對實驗性2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22 （8）: 1926-1927.

［10］ 張新杰，劉建坤，高冬梅，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28（10）: 1807-1811.

［11］ 金 丹，陸付耳.PI3K在2型糖尿病發(fā)病機制中的作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（1）: 21-23.

［12］ Han JW，Zhan X R，Li X Y，et al.ImPaired PI3K/Akt signa1 Pathway and hePatoce11u1ar injury in high-fat fed rats ［J］.World JGastroenterol，2010，16（48）: 6111-6118.

［13］ 張敬芳，王光浩，吳 勇，等.胰島素信號傳導(dǎo)與2型糖尿?。跩］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007.17（6）: 693-696.

［14］ 遲毓婧，李 晶，管又飛，等.PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路對糖代謝的調(diào)控作用［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2010，26（10）: 879-885.

［15］ 隋艷波，劉 莉，謝 寧，等.洋參御糖丸對糖尿病大鼠脂肪組織PI3K信號通路的調(diào)控作用［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41（3）: 85-87.

［16］ 王竹晨，邱 潔，賴偉英，等.脂肪組織中IRS-1相關(guān)的PI3K活性在多囊巢綜合征胰島素抵抗中的作用［J］.中山大學(xué)學(xué)報，2008，29（3）: 317-319.

*通信作者:肖子曾（1959—），男，教授，主要從事方劑的配伍理論及藥理作用研究。Te1: 13574801749，E-mai1: 1092341361@ qq.com

作者簡介:戴 冰（1964—），女，主任藥師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理學(xué)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1: 15973157636，E-mai1: db0223@163.com

基金項目:湖南省自然科學(xué)基金項目（13JJ3096）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃一般項目（2010FJ4091）；湖南省教育廳重點項目（15A140）；康爾佳藥業(yè)集團糖尿病研究所支持項目（2014）；長沙市科技局項目（K1106040-31）

收稿日期:2014-10-27

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0428-03