方詩琦， 瞿其揚， 仲歡歡， 李存玉，2， 彭國平，2， 鄭云楓，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

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甘草中5種三萜皂苷的同時測定及主成分分析

方詩琦1， 瞿其揚1， 仲歡歡1， 李存玉1，2， 彭國平1，2， 鄭云楓1，2*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023）

摘要:目的 建立HPLC法同時測定產于中國內蒙古、新疆、甘肅和烏茲別克斯坦的甘草中甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量。方法 甘草60％乙醇提取物的分析采用Hedera ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.2％甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30℃。然后，主成分分析（PCA）法對11批甘草中的三萜皂苷類成分進行分類。結果 這5個成分均顯示出良好的線性關系（r≥0.999 8），平均加樣回收率為97.7％～100.5％。而且，甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B對其質量有顯著影響。另外，可將內蒙古、新疆、甘肅產區(qū)的烏拉爾甘草與烏茲別克斯坦產區(qū)進行區(qū)分，但不能明顯表征這3個中國產區(qū)的差異。結論 該方法簡便快速，穩(wěn)定準確，可為甘草的鑒定和質量控制提供參考。

關鍵詞:甘草；三萜皂苷；主成分分析；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.023

KEY W 0RDS: 1icorice；triterPenoid saPonins；PrinciPa1 comPonent ana1ysis（PCA）；HPLC

甘草為豆科蝶形花亞科多年生草本植物，全國均有分布，主產于亞洲及歐洲。我國地處甘草資源中心地帶，也是世界上甘草使用量及出口量最大的國家，以新疆、內蒙古和甘肅為主產地。其中，作為法定的藥用甘草有烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖［1］。

作為多品種來源的中藥，甘草的質量評價一直受到國內外學者的關注［2-7］，但總體而言，其成分分析主要集中在黃酮類成分的定性或定量檢測，對皂苷類成分的研究并不深入。有文獻報道，甘草中除了甘草酸外，還含有一系列皂苷類活性成分［8-12］，它們在不同品種及產地的甘草中是否存在差異，對該植物的品質是否有影響，都是值得關注的問題。

本實驗以5個皂苷類成分（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸、烏拉爾甘草皂苷B）為指標，建立HPLC法同時測定甘草中這5個成分，并對產自內蒙古、新疆、甘肅等地區(qū)的甘草進行主成分分析，為進一步完善其質量控制與品質評價提供依據，也將為該資源的綜合利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ag1ient 1100高效液相色譜儀，包括G1314A紫外可見檢測器、G1314A二元泵、Agi1ent 1100色譜工作站（美國Agi1ent公司）；JCS-1000電子天平（凱豐集團有限公司）；BT125D分析天平（十萬分之一，賽多利斯科學儀器北京有限公司）；粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；KH-250B超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 甘草酸對照品（g1ycyrrhizin，純度≥98％，批號MUST-13083101，北京恒元啟天化工技術研究院、北京世紀奧科生物技術有限公司）；甘草皂苷M3（1icorice-saPonin M3）、22β-乙酰甘草酸（22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin）、甘草皂苷G2（1icoricesaPonin G2）、烏拉爾甘草皂苷B（ura1saPonin B）對照品（自制，純度均≥98％）；乙腈為色譜純（批號4B2935，美國Roe公司）；甲酸為分析純（批號12050210705，南京化學試劑有限公司）；甲醇為色譜純（批號20140616103，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）。

甘草藥材為豆科植物烏拉爾甘草G.uralensis、光果甘草G.glabra和脹果甘草G.inflate的干燥根及根莖，經南京中醫(yī)藥大學嚴輝副教授鑒定，符合《中國藥典》2010年版項下標準。不同產地甘草的來源見表1。

表1　樣品來源Tab.1 0 rlglns of sam ples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hedera ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；乙腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，28％～30％A；5～50 min，30％～40％A）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.甘草皂苷M32.22β-乙酰甘草酸 3.甘草皂苷G24.甘草酸 5.烏拉爾甘草皂苷B1.1icorice-saPonin M32.22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin 3.1icoricesaPonin G24.g1ycyrrhizin 5.ura1saPonin B圖1　對照品和樣品的HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B對照品適量，加甲醇溶解，制成5種對照品溶液。取上述溶液適量，置于同一量瓶中，制得甘草混合對照品溶液。其中，甘草皂苷M30.110 7 mg/mL、22β-乙酰甘草酸0.140 4 mg/mL、甘草皂苷G20.115 3 mg/mL、甘草酸1.839 6 mg/mL、烏拉爾甘草皂苷B 0.378 0 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取甘草藥材粉末（過3號篩）0.50 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60％乙醇25 mL，稱定質量，超聲提取30 min，靜置至室溫，密塞，再稱定質量，60％乙醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 含有量測定

2.4.1 對照品線性關系考察 取“2.2”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋法稀釋后配成系列對照品溶液，分別吸取10 μL注入液相色譜儀，進行測定，以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度（mg/L）為橫坐標（X）繪制標準曲線，得各對照品回歸方程及線性范圍，結果見表2。由表可知，5種成分在各自線性范圍內與其峰面積均呈良好的線性關系。

表2　5個三萜皂苷類成分的線性關系Tab.2 Llnear relatlonshlps of flve trlterpenold saponlns

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定各對照品峰面積。結果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.0％、0.96％、1.2％、0.63％和1.3％，表明儀器精密度較好。

2.4.3 重復性試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，精密吸取10 μL，在“2.1”項條件下測定。結果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.7％、1.9％、2.1％、1.0％和1.4％，表明該方法重復性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.3”項下供試品溶液，分別于0、2、4、8、16 h進樣10 μL測定。結果，甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的峰面積RSD分別為1.4％、1.8％、1.5％、0.78％和0.96％，表明供試品溶液在16 h內穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的甘草藥材粉末（樣品1）0.25 g（甘草皂苷M3、22β-乙酰甘草酸、甘草皂苷G2、甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量分別為0.93、1.86、2.64、55.47、8.94 mg/g），共6份，分別加入低、中、高3個質量濃度的對照品溶液適量（相當于藥材中各對照品原質量分數的80％、100％、120％），每個質量濃度取2份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算平均回收率，結果見表3。

表3　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests（n=6）

續(xù)表3　

2.4.6 樣品測定 取11批不同品種及產地的甘草藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測定，再按標準曲線分別計算不同地區(qū)甘草藥材中各成分的含有量，結果見表4。

表4　5個三萜皂苷類成分的含有量（mg/g）Tab.4 Contents of flve trlterpenold saponlns（mg/g）

2.5 主成分分析 應用SPSS 16.0軟件，將11批甘草藥材中5種三萜皂苷類成分的峰面積與藥材取樣量之比（即單位質量藥材峰面積）進行主成分分析，以特征值大于1者為提取標準，得到3個主成分，累積貢獻率達到91.86％。其中，第一主成分的方差貢獻率最大，為41.00％，包含的信息最多，第二主成分為29.66％，第三主成分為21.20％。由圖2可知，樣品能被明顯分成兩類，分界較明顯，樣品1～4（光果和脹果甘草）集中分布在左側，而樣品6～10（烏拉爾甘草）集中分布在右下側，但樣品5和11離群較遠，可能與三萜皂苷類成分的含有量有關。

圖2　主成分得分圖Flg.2 Score plot of prlnclpal components

因子負荷能反映各變量與主成分的相關性，其大小可表明各變量的影響程度。表5提供了5個色譜峰對于分類貢獻的信息，其中峰4、5在第一主成分中起決定性作用，顯著影響樣品的分類；峰2、3在第二主成分中有明顯的正相負荷；峰1對第三主成分影響較大。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 考察了甲醇-0.2％甲酸水、乙腈-0.2％甲酸水、甲醇/乙腈（2∶1）-0.2％甲酸水等不同比例的流動相體系，發(fā)現甲醇-0.2％甲酸水系統(tǒng)分離度最好，各峰的保留時間適中。為保證各指標性成分得到良好分離，還對Hedera ODS-2 （4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo Scientific ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同色譜柱進行研究，發(fā)現Hedera ODS-2色譜柱得到的各指標性成分峰形最好，分離效果最為理想。

表5　因子負荷矩陣Tab.5 Factor load lng matrlx

3.2 含有量測定分析與主成分分析 采用本實驗建立的色譜方法，對11個不同來源的甘草藥材進行了含有量測定。結果表明，同一品種不同產地或同一產地不同品種的5個指標性成分之間含有量差異很大，這可能與當地氣候、地理位置等生態(tài)環(huán)境，或種苗等遺傳因素相關［13］。其中，甘草皂苷M3受產地的影響最大，產自烏茲別克斯坦的樣品3、11及甘肅的樣品9、10均不含有該成分。因此，推測烏茲別克斯坦和甘肅產區(qū)可能不具備產生甘草皂苷M3的有利條件。

然后，將數據進行主成分分析，發(fā)現4個不同產地的甘草藥材具有一定的相似性和差異性。樣品1～4為光果甘草和脹果甘草，集中分布在圖2的左側，而樣品6～10均為烏拉爾甘草，集中分布在右下側，可推斷光果甘草與脹果甘草在兩個主成分上具有一定的相似性，而烏拉爾甘草與上述其他兩種甘草具有差異性。此外，樣品6～10產于我國新疆、內蒙古及甘肅，在圖2的分布較集中，而樣品11產自烏茲別克斯坦，離群較遠，故可用于烏拉爾甘草的中國與烏茲別克斯坦道地產區(qū)的區(qū)分。由表4可知，5和11號產地樣品與其他產地差異較大，可能是土壤環(huán)境、遺傳因素對植物中三萜皂苷類成分的影響較大，使得5號樣品中該類成分的含有量普遍偏低，而11號樣品偏高，這與主成分分析結果一致。

根據《中國藥典》2010年版，甘草以甘草酸為指標性成分，并規(guī)定了含有量范圍。結合本實驗數據發(fā)現，上述11個來源的甘草藥材中甘草酸含有量幾乎都明顯高于藥典規(guī)定（不得少于2％），說明現行藥典在甘草酸含有量限定上存在偏低情況，未能真實反映出藥材本身質量的優(yōu)劣差異，故建議下版藥典能對其含有量限定項進行相應修訂，使之更能客觀地反映藥材的質量現狀。另外，不同品種及產地的甘草藥材中均含有22β-乙酰甘草酸、甘草酸、甘草皂苷G2，但三者含有量差別較大，結合因子負荷矩陣可知，甘草酸和烏拉爾甘草皂苷B的含有量對甘草質量影響顯著，而且22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2也可產生一定的影響，故可將22β-乙酰甘草酸和甘草皂苷G2作為質量控制的另一指標。

三萜皂苷為甘草藥材中的主要活性成分，其種類雖單一，但含有量差異較大。本實驗通過對其含有量進行測定，可為初步區(qū)分我國各道地產區(qū)及控制從烏茲別克斯坦等中亞地區(qū)進口的甘草藥材質量提供參考價值。該方法簡便可靠，但由于三萜皂苷類成分對照品匱乏，藥材的來源不夠豐富，指標性成分的選擇不夠完善，故未能全面考察甘草藥材中三萜皂苷類成分的含有量。若采用一測多評法，實現以甘草酸為對照的多個成分進行同步測定，可為甘草中各有效成分含有量測定提供對比依據，為不同地區(qū)該植物的規(guī)范化種植、品種保護及質量控制奠定基礎。

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Slmultaneous determ lnatlon and prlnclpal com ponent analysls of flve trlterpenold saponlns ln llcorlce

FANG Shi-qi1， QU Qi-yang1， ZHONG Huan-huan1， LICun-yu1，2， PENG Guo-Ping1，2，ZHENG Yun-feng1，2 *
（1.School of Pharmacy，Nanjing University of ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing 210023，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous1y determining the contents of 1icorice-saPonin M3，22β-acetoxy1-g1ycyrrhizin，1icorice-saPonin G2，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B in 1icorice from Inner Mongo-1ia，Xinjiang，Gansu（China）and Uzbekistan.METH0DS The ana1ysis of 1icorice 60％ ethano1ic extractwas Performed on a Hedera ODS-2 co1umn（4.6 mm×250 mm，5 μm）in a gradiente1ution manner，mobi1e Phasewas acetonitri1e-0.2％ formic acid aqueous so1ution，f1ow rate was 1.0 mL/min，detection wave1ength was set at 254 nm，and co1umn temPeraturewasmaintained at30℃.Then PrinciPa1comPonentana1ysis（PCA）was used for the c1assification of triterPenoid saPonins in e1even batches of 1icorice.RESULTS These five constituents showed good 1inear re1ationshiPs（r≥0.999 8），whose arerage recoverieswere 97.7％ -100.5％.In addition，g1ycyrrhizin and ura1saPonin B had significant inf1uences on the qua1ity of 1icorice.Moreover，G.uralensis from Inner Mongo-1ia，Xinjiang and Gansu were different from Uzbekistan，but no c1ear distinction was characterized among these three Chinese growing areas.C0NCLUSI0N Thismethod is simP1e，raPid，stab1e and accurate，which can be aPP1ied to the qua1ity contro1of 1icorice.

*通信作者:鄭云楓（1979—），男，博士，副研究員，從事中藥化學成分研究與開發(fā)工作。Te1:（025）86798186；E-mai1: zyunfeng88@126.com

作者簡介:方詩琦（1991—），女，碩士，研究方向為中藥成分分離與分析。Te1:（025）86798186，E-mai1: fangsq8866@163.com

基金項目:國家自然科學基金項目（81202881）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（ysxk-2013）；江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心課題（ZDXM-2-8）

收稿日期:2015-08-07

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0336-06