岳佳琪， 馬桂芝， 付計(jì)瑞， 滕 亮， 王長(zhǎng)虹

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊830011；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

?

影響駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素

岳佳琪1， 馬桂芝1， 付計(jì)瑞1， 滕 亮2*， 王長(zhǎng)虹3*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊830011；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

摘要:目的 考察影響駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素。方法 離子凝膠法制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒，然后根據(jù)單因素與正交試驗(yàn)，考察殼聚糖、三聚磷酸鈉、吐溫-80、PH及攪拌時(shí)間對(duì)其粒徑大小的影響。結(jié)果最優(yōu)條件為殼聚糖質(zhì)量濃度1 mg/mL、三聚磷酸鈉用量6 mg、吐溫-80用量15 mg、PH 4、攪拌時(shí)間0.5 h，所得納米粒平均粒徑為（95±1.5）nm，Zeta電位為+（26±1.5）mV。結(jié)論 該條件穩(wěn)定、合理、具有可行性。

關(guān)鍵詞:駱駝蓬總生物堿；殼聚糖納米粒；離子凝膠法；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.013

KEY W 0RDS: P.harmala tota1a1ka1oid；chitosan nanoPartic1es；ionotroPic ge1ation method；sing1e factor ex-Periment；orthogona1exPeriment

駱駝蓬Peganum harmala L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物，含有生物堿、氨基酸、甾體、蒽醌、黃酮等成分［1］，其生物堿類(lèi)主要成分為駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿［2］。Moura及何丹丹等［3-4］研究發(fā)現(xiàn)，這些β-咔啉類(lèi)生物堿能夠改善物體識(shí)別模型小鼠的記憶。另外，駱駝蓬總生物堿對(duì)A1C13和D-半乳糖誘導(dǎo)的老年癡呆模型小鼠也有一定的保護(hù)作用［5］，其作用機(jī)制與該成分對(duì)乙酰膽堿酯酶（Acety1cho1inesterase，AChE）和丁酰膽堿酯酶（Butyry1cho1inesterase，BChE）分別表現(xiàn)出不同的選擇性抑制作用有關(guān)［6-7］，說(shuō)明駱駝蓬生物堿在改善學(xué)習(xí)記憶和防治老年癡呆方面具有較好的開(kāi)發(fā)前景。

納米藥物與普通制劑相比，具有溶解速率快、藥效穩(wěn)定、體內(nèi)釋放可控、穿透能力強(qiáng)及靶向性好等特點(diǎn)［8］。藥物實(shí)現(xiàn)腦靶向時(shí)，必須通過(guò)結(jié)構(gòu)致密的血腦屏障，而殼聚糖的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)中的多糖類(lèi)似，而且具有良好的生物可降解性及相容性，提示其有望成為腦靶向載體材料［9］。前期研究結(jié)果表明，駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒在小鼠體內(nèi)具有一定的腦靶向性［10］，但在制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，納米粒粒徑受各因素影響較大。而且，粒徑又是影響納米粒腦靶向性的重要因素之一，通常認(rèn)為實(shí)現(xiàn)腦靶向粒子的粒徑應(yīng)小于100 nm［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響離子凝膠法制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒粒徑的因素進(jìn)行考察，為控制納米粒粒徑大小提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 85 -1磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療器械廠）；FA1004分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；A11egra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；JEM-1230透射電鏡（日本JEM公司）；Zetasizer Nano S90高靈敏納米粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）。

1.2 試劑 駱駝蓬總生物堿（自制，批號(hào)20090303，駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的平均總含有量為87.3％）。氫氧化鈉（天津市南大化學(xué)試劑廠，批號(hào)020304）；冰醋酸（上海山浦化工有限公司，批號(hào)20100604）。殼聚糖（脫乙酰度90％，相對(duì)分子質(zhì)量50 000，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，批號(hào)20090807）；吐溫-80（天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠，批號(hào)070607）；三聚磷酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20080204）。

2 方法與結(jié)果

2.1 駱駝蓬總生物堿的制備 稱(chēng)取過(guò)20目篩的駱駝蓬種子粉末適量，加4倍量30％乙醇，回流提取7 h，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮液干燥，即得浸膏。稱(chēng)取浸膏粉適量，加4倍量0.5％鹽酸超聲溶解10 min，用氨水調(diào)至PH 9，放置24 h，過(guò)濾，濾液干燥，即得駱駝蓬總堿粗粉。再稱(chēng)取20 g，加3倍量95％乙醇，調(diào)節(jié)PH 13.5，回流提取15 min，過(guò)濾，濾液干燥，即得駱駝蓬總生物堿精制物。

2.2 考察指標(biāo) 以納米粒粒徑大小為指標(biāo)，對(duì)相關(guān)影響因素進(jìn)行考察。量取納米粒混懸液適量，應(yīng)用Zetasizer Nano S90馬爾文高靈敏納米粒度分析儀進(jìn)行粒徑的測(cè)量。

2.3 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的制備

2.3.1 殼聚糖含藥貯備溶液的制備 稱(chēng)取殼聚糖500 mg，用含有150 mg駱駝蓬總生物堿的2％冰醋酸溶解，定容至100 mL，放置溶脹24 h后，即得5 mg/mL的殼聚糖含藥儲(chǔ)備液。

2.3.2 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的制備 量取含藥儲(chǔ)備溶液適量加NaOH調(diào)PH，即得（Ⅰ）液。再稱(chēng)取適量，三聚磷酸鈉用水溶解，并緩慢加入（Ⅰ）液中，700 r/min攪拌一段時(shí)間，即得納米?；鞈乙?。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 殼聚糖濃度對(duì)納米粒粒徑的影響 分別量取含藥貯備液2、4、6、8、10 mL，用2％冰醋酸定容至20 mL，依次得到質(zhì)量濃度為0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的殼聚糖溶液，分別用NaOH調(diào)至PH=5（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉適量（殼聚糖-三聚磷酸鈉為10∶3），5 mL水溶解，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米?；鞈乙簻y(cè)定粒徑。結(jié)果當(dāng)殼聚糖濃度為2.5、2、1.5、1、0.5 mg/mL時(shí)，納米粒粒徑分別為（300±0.58）、（189±1.53）、（185±2.52）、（177±1.00）、（198±1.15）nm，表明隨著殼聚糖濃度的減小，納米粒粒徑先減小，后增大。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇殼聚糖2、1.5、1 mg/mL 3個(gè)水平進(jìn)行考察。

2.4.2 三聚磷酸鈉用量對(duì)納米粒粒徑的影響 量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 5（Ⅰ）。分別稱(chēng)取三聚磷酸鈉6、8、10、12 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米粒混懸液測(cè)量粒徑。結(jié)果當(dāng)三聚磷酸鈉用量分別為12、10、8、6 mg時(shí)，納米粒粒徑分別為（230±2.08）、（178± 1.00）、（168±0.58）、（198±1.73）nm，表明隨著三聚磷酸鈉用量的減少，粒徑先減小，后增大。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇三聚磷酸鈉10、8、6 mg 3個(gè)水平進(jìn)行考察。

2.4.3 PH對(duì)納米粒粒徑的影響 量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH分別為5、4、3（Ⅰ）。稱(chēng)取三聚磷酸鈉8 mg，溶解在5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌1 h，再取納米?；鞈乙簻y(cè)量粒徑。結(jié)果當(dāng)PH值分別為5、4、3時(shí)，納米粒粒徑分別為（177±2.00）、（149± 1.53）、（155±1.00）nm。

2.4.4 攪拌時(shí)間對(duì)納米粒粒徑的影響 量取含藥儲(chǔ)備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉8 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min分別攪拌1.5、1、0.5 h，再取納米粒混懸液測(cè)量粒徑。結(jié)果當(dāng)攪拌時(shí)間分別為1.5、1、0.5 h時(shí)，納米粒粒徑分別為（158± 1.73）、（151±2.08）、（146±1.00）nm。

2.5 納米粒的修飾 納米粒如要實(shí)現(xiàn)腦靶向性，粒徑須控制在100 nm以下。由于上述單因素考察發(fā)現(xiàn)，所得納米粒的粒徑大小與預(yù)想結(jié)果相差較大，故需對(duì)其進(jìn)行修飾，修飾材料為吐溫-80。量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。分別稱(chēng)取吐溫-80 15、25、35 mg，與三聚磷酸鈉8 mg溶解于5 mL水中，緩慢加入（Ⅰ）液，700 r/min攪拌0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y(cè)量粒徑。結(jié)果當(dāng)吐溫-80用量分別為15、25、35 mg時(shí)，納米粒粒徑分別為（111±2.08）、（119±2.65）、（141±1.15）nm，表明隨著吐溫-80用量的增加，粒徑也在增大。

2.6 正交試驗(yàn)考察

2.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 量取含藥儲(chǔ)備液適量，2％冰醋酸定容至20 mL，NaOH調(diào)至PH 4（Ⅰ）。取三聚磷酸鈉和吐溫-80適量，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ），700 r/min攪拌0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y(cè)量粒徑。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以殼聚糖濃度及三聚磷酸鈉、吐溫-80的用量為考察因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（n=3）Tab.2 L9（34）orthogonal experlment deslgn（n=3）

表3　正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 AN0 VA of orthogonal experlment

直觀分析結(jié)果表明，各因素對(duì)粒徑的影響順序?yàn)锽＜A＜C，優(yōu)選出的水平組合為A1B1C1。方差分析結(jié)果表明，三聚磷酸鈉用量對(duì)粒徑大小的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。最終，確定三聚磷酸鈉的用量6 mg、殼聚糖的質(zhì)量濃度1 mg/mL、吐溫-80的用量15 mg。

2.6.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照上述篩選的處方制備納米粒，量取含藥貯備液4 mL，2％冰醋酸定容至20 mL，得1 mg/mL的殼聚糖溶液，NaOH調(diào)PH 4（Ⅰ）。稱(chēng)取三聚磷酸鈉6 mg和吐溫-80 15 mg，溶解于5 mL水中，并緩慢加入（Ⅰ），700 r/min攪拌0.5 h，再取納米?；鞈乙簻y(cè)量粒徑。結(jié)果，3次試驗(yàn)的粒徑分別為93、95、96 nm，平均粒徑值為（95±1.5）nm，RSD=1.6％，說(shuō)明該條件穩(wěn)定、合理、具有可行性。

2.7 駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒的質(zhì)量表征

2.7.1 納米粒粒徑分布 按照正交試驗(yàn)優(yōu)選條件，制備駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒，用納米粒度分析儀測(cè)量粒徑的分布，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖可知，納米粒的粒徑集中分布在100 nm左右，粒度分布范圍為63～231 nm，分散指數(shù)（PDI）＜0.5，說(shuō)明納米粒成球形好、分布均勻［10］。

2.7.2 納米粒形態(tài)觀察 取駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米?；鞈乙哼m量，滴加在銅網(wǎng)上，用2％磷鎢酸鈉進(jìn)行負(fù)染，干燥5 min后置于樣品臺(tái)，用透射電鏡（TEM）對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1B、圖1C。由圖可知，納米粒的形態(tài)為球形或類(lèi)球形，分散性良好，無(wú)黏連現(xiàn)象［10］。

圖1　納米粒粒徑分布圖及透射電鏡照片F(xiàn)lg.1 Partlcle slze d lstrlbutlon of nanopartlcles and photos of transm lsslon electron m lcroscope

2.7.3 納米粒Zeta電位的考察 取駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米?；鞈乙哼m量，用粒徑儀測(cè)定3次Zeta電位。結(jié)果，Zeta電位分別為+28、+25、+ 26 mV，平均Zeta電位為+（26±1.5）mV。

3 討論

在凝膠化過(guò)程中，殼聚糖與三聚磷酸鈉分子間的交聯(lián)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，殼聚糖的質(zhì)量濃度及殼聚糖/三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對(duì)納米粒粒徑的影響顯著［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖質(zhì)量濃度過(guò)高，則會(huì)凝聚過(guò)度而發(fā)生凝絮；質(zhì)量濃度過(guò)低，則形成的納米粒粒徑增大，這將使離心要求變高。只有殼聚糖的質(zhì)量濃度為1.0～5.0 mg/mL，殼聚糖/三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為10∶3時(shí)，納米粒粒徑最小。而且，在納米粒制備過(guò)程中，兩者用量都不宜過(guò)高，否則會(huì)產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象。

采用吐溫-80修飾后，可避免殼聚糖納米粒出現(xiàn)黏連、粒徑增大等現(xiàn)象［13］，并可增加其腦靶向行性［14］。但其修飾駱駝蓬總生物堿殼聚糖納米粒時(shí)，對(duì)粒徑的影響并不明顯，修飾后PDI仍稍偏大，其原因有待進(jìn)一步考察。

若攪拌時(shí)間太短，三聚磷酸鈉分子間由于沒(méi)有分散均勻，則會(huì)出現(xiàn)局部凝聚現(xiàn)象，粒徑增大。隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖溶液的黏度隨之降低，致使殼聚糖與三聚磷酸鈉交聯(lián)不完全，剩余三聚磷酸鈉分子依然會(huì)部分凝聚，粒徑增大。結(jié)果表明，攪拌時(shí)間為0.5 h時(shí)粒徑最小，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，而且從粒徑的跨度來(lái)看，攪拌時(shí)間對(duì)粒徑大小的影響不大。

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Influenclal factors on the chltosan nanopartlcles slze of Peganum harmala total alkalold

YUE Jia-qi1， MA Gui-zhi1， FU Ji-rui1， TENG Liang2*， WANG Chang-hong3*
（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China；2.DePartment of Pharmacy，The First HosPital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China；3.Institute of ChineseMateria Medica，Shanghai University of Traditional ChineseMedicine；The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai201203，China）

ABSTRACT:AIM To investigate the inf1uencia1 factors on the chitosan nanoPartic1e size of Peganum harmala tota1a1ka1oid.M ETH 0 DS IonotroPic ge1ation method was aPP1ied in the PreParation of P.harmala tota1a1ka-1oid chitosan nanoPartic1es.The sing1e factor and orthogona1design were invo1ved in determining the effects of chitosan，sodium triPo1yPhosPhate，Tween-80，PH and stirring time on their size.RESULTS Being（95±1.5）nm in mean diameter and（26±1.5）mV in Zeta Potentia1，the nanoPartic1es found their oPtimum Process conditions at 1 mg/mL chitosan，6 mg sodium triPo1yPhosPhate，15 mg Tween-80，PH 4，and 0.5 h stirring time.C0NCLUSI0N The aforementioned oPtima1conditions for the PreParation of P.harmala tota1a1ka1oid chitosan nanoPartic1es are stab1e，reasonab1e and feasib1e.

*通信作者:滕 亮（1975—），男，博士，教授，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幮滤?。Te1:（0991）4362893，E-mai1: t1750212@126.com王長(zhǎng)虹（1964—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┡c體內(nèi)過(guò)程。Te1:（021）51322511，E-mai1: wchcxm@hotmai1.com

作者簡(jiǎn)介:岳佳琪（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幮滤?。Te1: 18703002639，E-mai1: 792075097@qq.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金—新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目（U1130303）；烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（G121320004）；上海市博士后科研資助計(jì)劃面上項(xiàng)目（13R21415800）

收稿日期:2015-08-17

中圖分類(lèi)號(hào):R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0294-05