胡曉苗,戴　銀*,沈?qū)W懷,趙瑞宏，張丹俊,胡順林，劉　東，劉秀梵*

(1.安徽農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.揚州大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009)

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2012年—2015年安徽部分地區(qū)發(fā)病家禽H9N2亞型禽流感流行情況分析

胡曉苗1,戴銀1*,沈?qū)W懷1,趙瑞宏1，張丹俊1,胡順林2，劉東2，劉秀梵2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.揚州大學獸醫(yī)學院農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009)

摘要：為了解安徽地區(qū)發(fā)病家禽中H9N2亞型禽流感(H9N2 subtype AI)的流行狀況，從2012年12月到2015年9月在安徽省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)臨床診斷中心和部分發(fā)病雞場，采集發(fā)生呼吸道疾病的雞、鴨、鵝等家禽的泄殖腔拭子和器官組織共368份，經(jīng)雞胚接種和HA、HI試驗鑒定，從25份樣品中分離到H9N2亞型AIV，分離率為6.79%。雞源樣品分離率為10.68%，高于鵝源樣品的分離率(2.13%)和鴨源樣品的分離率(1.47%)。H9N2 AIV的季節(jié)性分布較為明顯，冬季12月份至次年2月份的分離率最高，而夏季最熱的8月份則沒有分離到病毒。這些數(shù)據(jù)表明H9N2亞型AIV可以作為雞群呼吸道疾病的一個發(fā)病因素，應該繼續(xù)加強對其監(jiān)測。

關鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒；流行病學；家禽

我國自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza viruses,H9N2 subtype AIV)以來，H9N2亞型禽流感病毒仍是當前我國雞群中的主要的低致病性禽流感亞型。H9N2亞型禽流感病毒給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的危害，該病毒不但造成禽呼吸道疾病，還侵害家禽的生殖系統(tǒng)，造成蛋禽產(chǎn)蛋率下降，肉禽生長緩慢，同時易與其他病原微生物混合感染，造成死亡[1]。流感病毒在高強度的免疫選擇壓力下進化迅速，由病毒囊膜表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的編碼基因位點突變引起抗原漂移；而不同流感病毒之間也可能由基因片段的重組引起抗原轉(zhuǎn)移。H9N2亞型AIV在廣泛的疫苗選擇壓力之下，經(jīng)過長時間的演化，已出現(xiàn)一些變異群的毒株[2-4]，造成免疫失敗，給H9亞型禽流感的預防帶來了難度。目前有關安徽地區(qū)H9亞型禽流感的流行病學資料十分有限，加強安徽地區(qū)的H9亞型禽流感流行病學的持續(xù)性檢測，對于追蹤H9亞型禽流感的傳染源、分析傳播途徑與影響因素，以及制定正確的禽流感防控措施有著十分重要的意義。本研究利用安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所臨床診斷中心平臺，從2012年—2015年間持續(xù)對H9亞型禽流感進行了流行病學調(diào)查，旨在闡明H9亞型禽流感在安徽地區(qū)的流行狀況，為進一步的實驗室研究提供基礎材料，為安徽省H9亞型禽流感防控措施的制定提供可靠的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1運輸液(四抗PBS)運輸液的配制是根據(jù)OIE推薦的配方，由安徽農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室配置。配方如下：青霉素(Penicilin)10 000 U/mL，鏈霉素(Streptomycin)10 mg/mL，慶大霉素(Geamicin) 250 μg/mL，卡那霉素(Kanamycin)250 μg/mL，最后用10 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使運輸液的pH為7.2。

1.1.2參考陽性血清H9亞型AIV參考陽性血清,揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室提供。

1.1.3SPF雞胚SPF種蛋，購自山東省家禽研究所SPF種雞場，在本實驗室孵化至9日齡～11日齡備用。

1.1.4SPF雞紅細胞10 mL/L SPF雞紅細胞,安徽農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室制備。

1.1.5主要試劑H9抗原一步法膠體金檢測卡,購自上?？祆`試劑公司;RNA提取試劑Trizol Reagent,購自Invitrogen公司;RNA 酶抑制(RRI)、反轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA聚合酶等,購自TaKaRa公司;DNA回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit),購自Axygen 公司。

1.1.6病料臨床采集的病料來自安徽省合肥市周邊區(qū)域以及其他地區(qū)。樣品多樣，分別為蛋雞、土雞、肉雞、鵝、鴨等。從2012年12月～2015年9月，共采集368份臨床疑似禽流感發(fā)病家禽的組織器官和泄殖腔拭子樣品，其中雞病料206份，家鵝病料94份，家鴨病料68份。2012年雞病料45份，家鵝病料18份，家鴨病料18份，2013年雞病料104份，家鵝病料57份，家鴨病料30份，2014年雞病料57份，家鵝病料19份，家鴨病料20份。

1.2方法

1.2.1疑似H9亞型禽流感家禽的初步快速診斷調(diào)查發(fā)雞場的發(fā)病日齡、品種、產(chǎn)蛋率、死亡情況以及免疫程序等，觀察病雞的臨床癥狀并進行病理剖檢，拍照、做好記錄。采集氣管、腦、胰腺和泄殖腔拭子用膠體金試紙條進行初步快速診斷。

1.2.2病理剖檢及病料的采集病理剖檢時在無菌條件下，采取適量病禽組織器官(氣管、肺、胰腺、腦等)。采集泄殖腔拭子樣品時，將滅菌的棉拭子伸入家禽泄殖腔，轉(zhuǎn)動幾下，盡可能帶有糞便，將棉拭子頭折斷放入已提前加入1 mL運輸液的1.5 mL指形管中。處理樣品在超凈工作臺操作，組織器官剪碎后，加入適量的四抗PBS，然后用無菌研磨器，研磨至糊狀，與泄殖腔拭子一起倒入1.5 mL滅菌EP管中，放入-80℃冰箱反復凍融3次后，8 000 r/min離心10 min后取450 μL上清液，加入到相同體積四抗中再處理1次，準備接種。

1.2.3病毒的接種選取10日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，經(jīng)尿囊腔接種，每胚0.2 mL，每份病料接種3個雞胚。置36℃溫箱中孵化。每隔12 h觀察1次，棄去24 h內(nèi)的死胚。將死胚和接種5 d后還未死雞胚放入4℃冰箱過夜，逐一無菌收集尿囊液。用pH7.2的四抗PBS溶液進行10-3稀釋，盲傳接種，盲傳2代，收集尿囊液進行血凝(HA)試驗，備用。

1.2.4病毒鑒定

1.2.4.1H9亞型AIV HA亞型血清學鑒定用1.1.2所列出的標準陽性血清，進行HI試驗，確定病毒的HA亞型。將有血凝價的樣品分別用H9亞型參考陽性血清做血凝抑制試驗(HI)，按文獻[5]的方法進行，HI滴度≥24即判為陽性。凡涉及潛在感染性材料部分，均在揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病ABSL-3實驗室中完成。

1.2.4.2H9亞型HA和NA基因測序經(jīng)鑒定的H9亞型禽流感病毒尿囊液提取RNA，進行HA和NA基因測序。

病毒 RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄:用Trizol裂解法提取RNA，步驟參照Trizol試劑說明書。反轉(zhuǎn)錄：吹干后，用含12堿基隨機引物(序列：5′-AGCAAAAGCAGG-3′)的DEPC水(稀釋好的隨機引物3 μL，DEPC水32 μL，共35 μL)溶解提取出來的病毒RNA，置60℃水浴10 min，取出后立即置于冰盒中冷處理。約5 min后，加入反轉(zhuǎn)錄反應體系(10 μL 10×RT buffer，3 μL dNTP，1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，共15 μL)，置42℃水浴反轉(zhuǎn)錄1.5 h，之后取出，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR擴增病毒HA和NA基因:在GenBank中查找到H9N2相應基因片段的參考核苷酸序列，采用Primer v5引物設計軟件設計，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。采用PCR分段擴增病毒HA基因片段[6]，HA基因預期擴增片段約為1 700 bp，分段擴增的片段長為600 bp和1 400 bp，引物的核苷酸序列如下：H9 HA-F:5′-AGCAAAAGCAGGGG-3′，H9 HA-M-R:5′-GTCACACTTGTTGTTGTRTC-3′;HA-M-F:5′-CTYCACACAGARCACAATGG-3′，HA-R: 5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′。NA基因預期擴增片段約1 413 bp，引物的核苷酸序列如下：NA2-F：5′-TCCGTTTCATTTGGGAACC-3′，NA2-R：5′-CTGACAATGGRCTAATGTG-3′。

測序及序列拼接、分析：PCR產(chǎn)物回收、送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。返回的序列采用DNA Star4.0版本中的EditSeq、MegAlign來進行序列拼接和比對分析。

2結(jié)果

2.1疑似H9亞型禽流感家禽的初步快速診斷

疑似H9亞型禽流感家禽泄殖腔拭子用膠體金試紙條進行初步快速診斷，陽性結(jié)果見圖1。

2.2H9亞型禽流感病毒混合感染典型解剖病變

伴發(fā)大腸埃希菌、沙門菌及支原體等混合感染時，出現(xiàn)氣囊渾濁、“包心包肝”、氣管堵塞等細菌繼發(fā)感染病變(圖2)。

圖1　H9金標試紙條陽性

2.3HA和NA基因擴增結(jié)果

HA基因分段擴增出600 bp和1 400 bp 2個片段，NA基因為1 400 bp(圖3)。

2.4H9流行病學調(diào)查結(jié)果

發(fā)病雞群日齡相差較大，其中日齡小的較多，發(fā)病之前沒有免疫接種過H9亞型禽流感疫苗或7日齡時只接種過1次新支流油乳劑疫苗。這些發(fā)病家禽均伴有不同程度的呼吸道感染，死亡率比較低。如果伴發(fā)大腸埃希菌、沙門菌及支原體等混合感染，日齡較小的家禽則出現(xiàn)較大的死亡，使用抗生素后，死亡率仍不見明顯下降，解剖病死家禽可以看到氣囊渾濁、“包心包肝”、氣管堵塞等病變。某些家禽用了抗病毒藥物之后，整體狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，死亡率也明顯下降。家禽一旦發(fā)病，傳播速度快，呈蔓延趨勢，造成了巨大的經(jīng)濟損失。

2.4.1H9亞型禽流感病毒的總分離率用雞胚尿囊腔傳代接種法進行病毒分離。對有血凝活性的樣品進行鑒定，經(jīng)過HI試驗和RT-PCR 共分離到H9N2亞型禽流感病毒25株，總分離率為6.79%(25/368)。

A.支氣管堵塞;B.氣管內(nèi)黏液;C.包肝;D.包心;E.氣囊干酪樣物

A.Bronchial embolization;B.The mucus in the trachea;C.The capsule of liver;D.The capsule of heart;E.Cheesy materials in air sac

圖2病理變化

Fig.2Pathological lesions

1.HA上段；2.HA下段；3.NA ；4.DNA標準DL 3 000；5～7.陽性對照；8.陰性對照

1.Upper section of HA ;2.Next section of HA ;3.NA ;4. DNA Marker DL 3 000 ;5-7.Positive control ;8.Nective control

圖3HA和NA基因PCR擴增結(jié)果

Fig.3PCR amplification results of HA and NA genes

2.4.2H9亞型禽流感病毒在不同家禽中的分布此次H9亞型禽流感病毒全部分離自臨床發(fā)生呼吸道癥狀的家禽，其中2012年分離到5例(雞4例、鵝1例)，2013年9例(全部為雞源)，2014年7例(雞5例、鵝1例、鴨1例)，2015年4例(全部為雞源)。統(tǒng)計可知病雞中分離率最高，達到10.68%(22/206)，其次為鵝2.13% (2/94)和鴨1.47% (1/68)(圖4)。其中從病雞中分離的只有極少部分是從大型養(yǎng)殖場中分離的，占到9.09%(2/22)。

圖4　2012年—2014年H9N2AIV各宿主分離率分布情況

2.4.3H9N2禽流感病毒分離率的季節(jié)性分布以公歷3月、4月、5月份為春季，6月、7月、8月份為夏季，9月、10月、11月份為秋季，12月、1月、2月份為冬季。H9亞型禽流感病毒冬季分離最多(圖5)，為11例，春季分離5例，秋季分離1例，2015年夏季分離1例，夏季能分離可能是因為2014年和2015年安徽夏天陰雨天多，氣候涼爽，紫外線不強，禽流感病毒能夠生存。

3討論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV在家禽呼吸道疾病中的感染率很高，總分離率為6.79%。從樣品背景調(diào)查中可知，80%是從規(guī)模較小的養(yǎng)殖場或者散戶(2 000只以下)中分離到的。因此，應該重視H9亞型禽流感疫苗的免疫接種工作，產(chǎn)蛋雞累計免疫次數(shù)最低為3次。

圖5　H9亞型禽流感病毒各月份分離情況

由于H9亞型禽流感為非強制免疫的疫苗，養(yǎng)禽場特別是肉禽場對H9亞型低致病性禽流感疏于防范，導致H9亞型為主的低致病性禽流感在禽群大范圍流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，給該病的防控工作帶來極大的困難。

本項調(diào)查發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV在鴨、鵝和鴿中的感染率分別為10.68%(22/206)、2.13% (2/94)和1.47% (1/68)，在雞中感染率高于鴨、鵝和鴿。這與以前報道的調(diào)查是一致的，可能是因為該病毒通過變異，在雞群中獲得更強的適應性[7]。

由于安徽省的養(yǎng)禽業(yè)以散養(yǎng)戶和專業(yè)戶飼養(yǎng)模式為主，禽品種繁雜。小養(yǎng)殖戶生產(chǎn)力水平低，缺少現(xiàn)代養(yǎng)殖和管理技術(shù)，免疫程序不合理，治理粗放、衛(wèi)生狀況和防疫條件差，通風差。雞鴨混養(yǎng)且常共用一水源，人、豬、雞同在一處房間的也不乏其數(shù)。H9亞型AIV除感染禽類外，偶爾會從家禽傳播到哺乳動物，也危及人類的健康及安全[8-9]。這種狀況增加了禽流感的防控難度，同時也增加了人感染禽流感病毒的概率, 公共衛(wèi)生學意義日益突出，必須引起高度重視和預警，切實做好H9亞型禽流感的防控，保障養(yǎng)禽業(yè)穩(wěn)定發(fā)展和人類的健康[10]。

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Epidemiological Survey on H9N2 Subtypes of Avian Influenza in Patr Area of Anhui Province from 2012 to 2015

HU Xiao-miao1,DAI Yin1,SHEN Xue-huai1,ZHAO Rui-hong1,ZHANG Dan-jun1,HU Shun-lin2,LIU Dong2,LIU Xiu-fan2

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei,Anhui,230031,China;2.KeyLaboratoryofAnimalInfectiousDiseasesofMinistryofAgriculture,CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

Abstract:To investigate the epidemiology of H9N2 subtype avian influenza (H9N2 subtype AI) in poultry in Anhui province,we surveyed H9N2 subtype AIV in the veterinary clinical diagnosis center of Anhui Provincial Academy of Agricultural Sciences and part farms.From December 2012 to September 2015,368 organ tissues and cloacal swab samples were collected from poultry with respiratory diseases.25 strains of H9N2 subtype AIV were isolated with an isolation rate of 6.79% by inoculating embryonated hens eggs,hemagglutination(HA) and hemagglutination inhibition(HI) tests.The isolation rate of chicken source was 10.68%,which was higher than that of the goose source(2.13%) and the duck source(1.47%).The seasonal distribution of H9N2 was obvious and the isolation rate was highest in winter during December to February,while no isolation in August-the hottest month in summer.The result indicated that H9N2 subtype AIV may be an important factor in the pathogenesis of respiratory diseases in chickens,and monitoring of it should be reinforced.

Key words:H9N2 subtype avian influenza virus;epidemiology;poultry

文章編號:1007-5038(2016)03-0127-04

中圖分類號:S852.659.5

文獻標識碼:B

作者簡介：胡曉苗(1971-)，男，安徽望江人，碩士，助理研究員，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學研究。*通訊作者

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-41)；安徽省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊項目(11C0404)；國家自然科學基金項目(31302044)

收稿日期：2015-10-19