王　華，包靜月，吳曉東，劉春菊，王淑娟，王志亮

(中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032)

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內(nèi)蒙古和西藏自治區(qū)野生反芻動(dòng)物小反芻獸疫監(jiān)測

王華，包靜月，吳曉東，劉春菊，王淑娟，王志亮*

(中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032)

摘要：為了解小反芻獸疫疫情在野生反芻動(dòng)物中的流行情況，在風(fēng)險(xiǎn)較高且野生動(dòng)物集中分布的內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市、呼倫貝爾市和興安盟以及西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)、山南地區(qū)、阿里地區(qū)和那曲地區(qū)，平行采集棉拭子樣品和血清樣品各78份。通過RT-PCR檢測小反芻獸疫病毒核酸，同時(shí)用競爭ELISA檢測反芻野生動(dòng)物血清中的小反芻獸疫病毒特異性抗體。結(jié)果檢測樣品中未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。說明該批次樣品中沒有發(fā)現(xiàn)野生動(dòng)物感染小反芻獸疫病毒。研究結(jié)果可為小反芻獸疫防控工作提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小反芻獸疫； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；野生反芻動(dòng)物；監(jiān)測

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的小反芻動(dòng)物以發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為特征的一種急性、烈性傳染病。本病目前主要分布在非洲和亞洲地區(qū)，PPR的暴發(fā)和流行對一個(gè)國家的養(yǎng)羊業(yè)、經(jīng)濟(jì)貿(mào)易或者食品安全均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的損害。通過核酸序列分析PPRV的F和N蛋白基因序列，將PPRV可以分為4個(gè)系(Ⅰ-Ⅳ)。由于PPR具有較高的發(fā)病率和病死率，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE )列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病，是國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012年—2020年)中優(yōu)先防控的外來疫病之一。PPR也是重要的跨境動(dòng)物疫病[1-2]。

最初，PPR疫情僅局限于自然宿主-家養(yǎng)的山羊和綿羊。野生反芻動(dòng)物的易感性并未證實(shí)。1976年，Hamdy 和Dardiri用塞內(nèi)加爾和尼日利亞PPRV毒株人工實(shí)驗(yàn)感染美國白尾鹿，證實(shí)了PPRV能夠感染野生反芻動(dòng)物。截止目前文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道野生動(dòng)物感染PPRV的宿主包括非洲水羚、阿拉伯山羚羊、南非跳羚、阿拉伯瞪羚、芭芭利野綿羊、羚羊、黑斑羚、阿富汗捻角山羊、信德野山羊、白尾鹿、巖羊、野山羊、小鹿瞪羊、湯氏瞪羊、鵝喉羚、黑尾瞪羊、好望角大羚羊、拉利斯頓羊、努比亞野山羊、印度水牛、非洲灰鸚鵡小羚羊、狷羚、非洲大羚羊。牛、水牛和豬也能感染PPRV，但都不表現(xiàn)臨床癥狀,也有駱駝感染PPRV的報(bào)道[3]。其他的研究報(bào)道如動(dòng)物園中的野山羊、東方盤羊等野生動(dòng)物感染PPRV死亡的病例[4]。根據(jù)2015年8月份OIE公布的野生反芻動(dòng)物感染PPR疫情的國家主要有非洲的摩洛哥、馬里、利比里亞、剛果、贊比亞、烏干達(dá)、肯尼亞和亞洲的中國與塔吉克斯坦，共計(jì)9個(gè)國家。研究人員認(rèn)為野生反芻動(dòng)物對本病敏感。我國西藏也曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)過2次野生羊發(fā)病死亡的疫情。1次是藏原羊、1次是巖羊，表明自然感染下，野羊嚴(yán)重感染可能導(dǎo)致死亡。一般情況下，野羊主要是與發(fā)病的家羊接觸而感染。

2013年年底至2014年期間，我國的大部分地區(qū)先后暴發(fā)了PPR疫情，通過及時(shí)有效的采取措施后，最終疫情得以有效的控制。由此推測，當(dāng)家羊大范圍發(fā)生疫情時(shí)，野羊感染的概率是否會(huì)進(jìn)一步增加，它們在疫病傳播中的作用是否會(huì)增大。本研究的目的主要是對未免疫接種PPR疫苗的反芻野生動(dòng)物進(jìn)行病原學(xué)和血清學(xué)抗體監(jiān)測，評估這些反芻野生動(dòng)物攜帶病毒情況，為PPR疫情流行和傳播提供技術(shù)支持，為控制PPR疫情提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器設(shè)備PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)板孵育器( MB100-4P)，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Sunrise Rmote)，Tecan Austria GmbH 公司產(chǎn)品；離心機(jī)(Sorvall fresco)，美國索福公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑High Pure Viral RNA Kit購自Roche 公司;One Step RT-PCR Kit 購自TaKaRa公司;PPR 競爭ELISA抗體檢測試劑盒購自法國ID VET公司。

1.2方法

1.2.1野生動(dòng)物樣品采集本試驗(yàn)中檢測用樣品來自2014年內(nèi)蒙古自治區(qū)的赤峰市、呼倫貝爾市、興安盟，西藏自治區(qū)的日喀則地區(qū)、山南地區(qū)、阿里地區(qū)和那曲地區(qū)送檢的平行采集野生反芻動(dòng)物的口鼻拭子和血清。赤峰市克什克騰旗狍子6只，烏蘭布統(tǒng)麋鹿7只；呼倫貝爾市盟額爾古納馬鹿8只，鄂溫克旗馬鹿9只；興安盟科爾沁右翼中旗馬鹿10只，扎賁特旗梅花鹿9只；日喀則地區(qū)聶拉木縣折巴鄉(xiāng)巖羊2只，南木林縣仁堆鄉(xiāng)黃羊4只；山南地區(qū)洛扎縣扎日鄉(xiāng)巖羊3只，黃羊5只；阿里地區(qū)改則縣物馬鄉(xiāng)黃羊6只；那曲地區(qū)尼瑪縣俄久鄉(xiāng)藏羚羊2只，野牦牛5只；其中拭子和血清樣品分別為馬鹿27份，黃羊15份，梅花鹿9份，麋鹿7份，巖羊7份，狍子6份，野牦牛5份，藏羚羊2份。拭子樣品共計(jì)78

份，血清樣品共計(jì)78份。血清樣品均采集自未免疫接種PPR疫苗的野生動(dòng)物。樣品分別由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院和西藏自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。所收集的拭子和血清樣品進(jìn)行登記編號后，置-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品檢測棉拭子樣品通過核酸提取后，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

血清樣品按照ID VET試劑盒說明書操作。結(jié)果成立滿足陰性對照平均OD值大于0.7，平均陽性對照值和平均陰性對照值的比值小于0.3。 結(jié)果判定：PI=樣品OD值/陰性對照平均值×100，PI≤50%，判定為陽性；50%60%判定為陰性。

2結(jié)果

對采集的野生反芻動(dòng)物棉拭子和血清樣品分別進(jìn)行RT-PCR和cELISA檢測，RT-PCR檢測結(jié)果全部為陰性，cELISA檢測結(jié)果全部為陰性(圖1)。說明該批次送檢樣品中未發(fā)現(xiàn)野生反芻動(dòng)物感染PPRV(表1)。

圖1　野生反芻動(dòng)物血清PPRV cELSIA 檢測結(jié)果

反芻動(dòng)物Ruminants棉拭子/個(gè)Cottonswabs血清/個(gè)SerumRT-PCR/ELISA陽性數(shù)RT-PCR/ELISApositivenumber馬鹿Reddeer27270黃羊Mongoliangazelle15150梅花鹿Deer990麋鹿Wapiti770巖羊Bluesheep770狍子Roedeer660野牦牛Yak550藏羚羊Tibetanantelope220總計(jì)Total78780

3討論

PPR作為跨境動(dòng)物疫病對其他未感染的國家和地區(qū)不僅僅包括它們的鄰國，也包括它們潛在的貿(mào)易伙伴都存在著很高的傳播風(fēng)險(xiǎn)。PPR傳播范圍廣泛，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重危害。我國周邊國家孟加拉國、阿富汗、老撾、緬甸、印度、尼泊爾、巴基斯坦、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦和蒙古國等均有過PPR疫情的報(bào)道。該病主要通過氣溶膠和直接接觸近距離的傳播。2014年我國各地大面積暴發(fā)了PPR疫情，經(jīng)過采取綜合防控措施后，防止疫情蔓延，疫情最終得以有效控制[5-7]。

PPRV在野生反芻動(dòng)物間的傳播易感性與野生反芻動(dòng)物群體的接觸頻率或者與相同的種群的接觸率有關(guān)。在中東地區(qū)，易感的野生反芻動(dòng)物的移動(dòng)可能導(dǎo)致了疫情的擴(kuò)散。野生反芻動(dòng)物的移動(dòng)主要通過自然的遷徙或者通過運(yùn)輸方式到動(dòng)物園。季節(jié)性的遷徙能夠遠(yuǎn)距離傳播疫情，也能夠跨界傳播。野生反芻動(dòng)物的移動(dòng)會(huì)導(dǎo)致病毒跨境傳播到其他國家甚至大洲。我國西藏野生巖羊樣品檢測出PPRV，巖羊不僅在我國青藏高原存在，尼泊爾、巴基斯坦、不丹和印度也有巖羊生存。家庭飼養(yǎng)的綿羊和山羊與野生反芻動(dòng)物共用天然牧場，這促使了PPRV在這兩個(gè)種群間的傳播[8-9]。因此，PPRV很可能傳播給我國野生反芻動(dòng)物。另外，邊境省份尤其是養(yǎng)羊大省為少數(shù)民族地區(qū)，存在混牧、過牧現(xiàn)象，加大了羊群與野生反芻動(dòng)物接觸的機(jī)會(huì)，增大了野生反芻動(dòng)物感染和傳播PPR疫情的風(fēng)險(xiǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)全球根除PPR這個(gè)目標(biāo)，F(xiàn)AO 和OIE 共同幫助發(fā)展中國家預(yù)防和控制跨境動(dòng)物疫病。各國政府尤其是有疫情的國家政府要高度重視PPR疫情傳播到新的區(qū)域和地方的風(fēng)險(xiǎn)。建立全球和地區(qū)的PPR監(jiān)測措施(包括免疫和流通環(huán)節(jié))[10-12]。由于野生反芻動(dòng)物流動(dòng)性較大，捕捉難度大，采集的樣品均為野外生存的野生反芻動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)室從2012年開展了野生反芻動(dòng)物PPR主動(dòng)監(jiān)測工作，每年送檢的野生反芻動(dòng)物樣品地區(qū)和數(shù)量僅20余份，監(jiān)測結(jié)果均為陰性。2014年所收集的野生反芻動(dòng)物棉拭子和血清樣品，數(shù)量雖然有限，但采集的地區(qū)和數(shù)量顯著增加。該批次樣品檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)PPRV核酸和抗體，說明在國內(nèi)PPR大流行期間，送檢的野生反芻動(dòng)物樣品中沒有發(fā)現(xiàn)PPR病例。但是并不能完全排除沒有野生反芻動(dòng)物感染的可能性。按照國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012年—2020年)中外來動(dòng)物疫病防控的要求，為了實(shí)現(xiàn)我國根除小反芻獸疫疫情的目標(biāo)，為了掌握邊境省份未免疫接種PPR疫苗的野生反芻動(dòng)物是否感染PPRV，仍需要持續(xù)監(jiān)測野生反芻動(dòng)物血清抗體和進(jìn)行病原學(xué)檢測，為根除PPR疫情提供技術(shù)支持，為區(qū)域性PPR防控提供科學(xué)依據(jù)。

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Survey of Peste des Petits Ruminants of Wild Ruminants in Inner Mongolia and Tibet

WANG Hua, BAO Jing-yue,WU Xiao-dong,LIU Chun-ju,WANG Shu-juan,WANG Zhi-liang

(ExoticAnimalDiseasesResearchCenterofChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao,Shandong,266032,China)

Abstract:In order to understand the epidemiological characteristics of peste des petits ruminants (PPR) in wild ruminants,the total received 78 cotton swab samples and 78 serum samples from highly risk of wild ruminants in Chifeng city,Hulunbuir city,Hinggan League of Inner Mongolia autonomous region and Xigaze,Shannan,Ali and Naqu of Tibet autonomous region.All the cotton swab samples were tested by RT-PCR,and serum samples were tested by competitive ELISA.The results showed all the samples were negative in the wild animals,indicating no PPR epidemic occurs in wild ruminants of above regions.The results may provide the basis for the prevention and control of PPR.

Key words:PPR;ELISA;RT-PCR;wild ruminant;survey

文章編號:1007-5038(2016)03-0124-03

中圖分類號:S852.659.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B

作者簡介：王華(1977-)，男，河南舞鋼人，獸醫(yī)師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。 *通訊作者

基金項(xiàng)目：邊境地區(qū)動(dòng)物疫病防控技術(shù)體系研究(201103008)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(NYCYTX-0305)；MATS(2060302)

收稿日期：2015-09-08